GFP在蛋白质相互作用研究中的应用资料.docx

1.GFP在蛋白质相互作用研究中的应用在活体内检测蛋白与蛋白相互作用，对我们理解生物学过程至关重要。研究蛋白质相互作用的经典技术是酵母双杂交系统。它是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法，由Fields和Song等人于1989年首次建立，随后在蛋白相互作用研究领域广泛应用。酵母双杂交系统的实验过程，就是将已知蛋白作为诱饵蛋白，在系统中捕获与其相互作用的蛋白质。来源于水母的GFP在此系统中得到了广泛应用，人们可用它直接监测蛋白质与蛋白质的相互作用。科学家利用两个增强型GFP（EGFP）片段重建功能，从而开发出一种新型的报告系统以应用于酵母双杂交系统。该系统在基因水平上将EGFP片段分别与诱饵蛋白及要捕获的蛋白融合，在体内共表达，从而研究蛋白与蛋白间的相互作用。与现有的酵母双杂交系统相比，EGFP系统中的诱饵、靶蛋白载体的报告基因和复制控制元件均得到了改进。在酵母中，当蛋白与蛋白发生相互作用时，分开的EGFP能够重新结合而发出荧光(图7)1.1构建分离的EGFP报告质粒以分离的EGFP作为酵母双杂交系统的报告基因有明显的优势，因为它不需要外源底物及辅助因子就能发出荧光。从理论上讲，该报告系统的基础是酵母中蛋白与蛋白间发生相互作用后，被分开的荧光蛋白片段会再次互相结合从而发出荧光。EGFP报告质粒包括pNEGFP和pCEGFP。构建模式见图8。在乙醇脱氢酶1（ADH1）启动子控