南医生化实验3讲义.docVIP

生物化学实验报告 一、实验目的实验原理材料与方法 四、结果与讨论 斑点-原点距离（cm） 溶剂前缘-原点距离（cm） Rf值 精氨酸（Arg） 1.3 6.1 0.2 甘氨酸（Gly） 2.4 6.1 0.4 丙氨酸（Ala） 2.8 6.0 0.5 混合点1 1.4 6.0 0.2 混合点2 2.4 6.0 0.4 混合点3 3.0 6.0 0.5 如上表，混合点1的Rf与精氨酸的Rf相等，混合点2的Rf与甘氨酸的Rf相等，混合点3Rf的与丙氨酸的Rf相等。结合实验原理与实验数据即可得出结论：混合的氨基酸溶液含有精氨酸、甘氨酸和丙氨酸三种氨基酸。 结果分析 经查阅资料和与同学讨论得以下几点注意事项： （1）制作层析板所用的玻璃板一定要清洁平整且无油污； （2）制作层析板的时候，应该将粘在玻璃板侧面边上的硅胶粉去掉，否则在层析的时候会有较强的边缘效应； （3）展板时，展层-显色剂应该低于点样线； （4）若吸附剂的颗粒太大，展开时溶剂的推进速度过快，则分离效果不好；若颗粒太小，展开时溶剂的推进速度过慢，则会出现斑点拖尾现象，亦不能得到很好的分离效果。因此，薄层层析使用的吸附剂如硅胶的颗粒大小一般以通过200目左右筛孔为宜； （5）整个层析过程中，应该避免用手接触层析板，否则手上的汗渍将污染层析板，因此必要时可以戴上手套； （6）点样时，样品量太少则不容易显示出成分；样品量太多则容易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。因此，要求点样后斑点直径一般为2mm； （7）为避免层析液挥发，应在层析缸盖上涂上凡士林； （8）要注意观察溶剂前缘与薄板顶端的距离，当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，要停止展层，否则氨基酸将随展层剂扩散到层析板外。 3.讨论总结 硅胶的吸附力与含水量的问题 经查阅资料和与同学讨论得，硅胶的吸附力与含水量呈负相关，即含水量高，吸附力弱；含水量低，吸附力强。 吸附实验中吸附剂的选择根据 经查阅资料和与同学讨论得，我们应该综合需要吸附的吸附质、再生温度等条件来选择吸附剂。此外，倘若吸附剂的颗粒太大，展开时溶剂的推进速度过快，则分离效果不好；倘若颗粒太小，展开时溶剂的推进速度过慢，则会出现斑点拖尾现象，亦不能得到很好的分离效果。因此，薄层层析使用的吸附剂如硅胶的颗粒大小一般以通过200目左右筛孔为宜。 氨基酸纸层析与薄层层析法两者的区别 经查阅资料得，不同于氨基酸的薄层层析法，氨基酸的纸层析法是一种以滤纸作为支持物的分配层析法。与滤纸纤维亲和力强的水被吸附在纤维之间形成固定相，与滤纸亲和力弱的有机溶剂如醇、酚等为常用的流动相。用滤纸做层析实验，效果重复性相对于薄层层析要差一点，对分离物的吸附性更强一些，因此需要用极性比较大一些的展开剂进行操作。 （3）室温下，将玻璃板水平放置0.5h，自然晾干 （2）取洁净干燥的玻璃板均匀涂层 （1）称取3g硅胶，量取8ml的0.5%羧甲基纤维素钠，并将二者混合均匀 （5）取出层析板，用铅笔在距底边2cm处画一条水平点样线，并在线上作出距离均匀的4个点 （4）将层析板置于烘箱70℃烘干1h （7）将层析板点样端浸入展色-显色剂，注意展层-显色剂液面应低于点样线，盖好层析缸盖 （6）用毛细玻璃管分别吸取丙氨酸溶液、精氨酸溶液、甘氨酸溶液及混合氨基酸溶液，轻轻点样在层析板水平线上的4个点上，注意加样原点扩散直径不能超过2mm （9）将层析板置于烘箱中烘干，显色后取出层析板，对各斑点进行距离测量，记录数据并根据公式计算Rf （8）层析剂前沿到达层析板的1/2处时，停止展板，取出层析板，用铅笔描出溶剂前沿界线