基因工程的常规技术概论.ppt

DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP 化学法(Chemical sequencing) [美]Maxam－Gilbert 1977年建立，是唯一能直接应用于双链DNA测序的方法。 原理： 利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群经测序胶电泳和放射自显影得到侧序图谱。 步骤： (1)5`脱磷：经限制酶切过的任意长度的片断，先用磷酸酯酶除去末端的磷； P OH 磷酸酯酶 OH OH OH P OH OH (2)5`末端标记: T4多核苷酸激酶 P OH 进一步处理 OH P (3)制备仅一端有标记的DNA： ①用限制性酶从中部切开双链DNA，再用电 泳分离，得到2个有末端标记的DNA片断； P OH P OH OH P OH P ②将末端标记的双链DNA变性，经电泳分离， 得到2个有末端标记的ssDNA片断; 此法可测 100Nt 的序列。 (4)修饰，除碱基： ①裂解G和A的反应 (强G弱A裂解，G A)： 硫酸二甲酯(DMS)作用DNA，使G(N7)和A(N3)甲基化，甲基化的G和A糖苷键不稳定，在中性(pH=7)条件下加热，G和A脱落； ②强A弱G反应(AG)：在弱酸条件下进行上述反应，两个图谱平行作出，便于比较判断。 ③裂解C和T的反应 (C+T): 肼和哌啶催化反应。 ④裂解C的反应：上述反应中当有2M NaCl存在时，可选择性地抑制肼对T的作用，故仅C脱落。 (5)切断磷酸二酯键： 90℃，用0.1M碱处理，相应的磷酸二酯键断裂， 这样就可得到一组大小不等的有末端标记的片断。 (6)电泳 ：因G甲基化的速度比A快5倍,故得到片断的量也比A的大5倍,使电泳带深于A。 C和T的裂解反应 测序凝胶电泳 根据用途 信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。 芯片特点 优点： ①微型化 ：平方厘米大小，实验所需试剂用量少 ②高通量：一次检测数万个分子 ③自动化 ④标准化 ： 传统方法检测众多基因要经历多次实 验，因而每次实验之间是存在系统误差的。 缺点： 在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不 同。 生物芯片的应用 基因表达水平的检测 基因诊断 药物筛选 个体化医疗 测序 生物信息学研究 基因芯片（又称 DNA 芯片）是生物芯片的一种类型，它是将 DNA 分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中 mRNA 的表达量，也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定，为进一步了解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具。 二、基因芯片技术的发展史 1989 年英国牛津大学的 Southern 等取得了在刚性载体表面固定寡聚核苷酸及杂交法测序的专利；与此同时俄罗斯和美国的科学家也提出了运用杂交法测定核酸序列（SBH）的设想。 1994 年研制出了一种基因芯片并用于检测 β-地中海贫血病的基因突变，筛选了一百多个 β-地中海贫血病已知的突变基因。 1995 年，一些国际大公司与研究机构合作共同开发具有商业价值的生物芯片及其相关的分析技术。1997 年世界上第一张全基因组基因芯片——含有 6116 个基因的酵母全基因组芯片在斯坦福大学 Brown 实验室完成。从而使基因芯片技术在世界上快速得到应用。 三、基因芯片技术的