高速逆流色谱法精要.pptVIP

本章总结 HSCCC利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱过程中能保留大量固定相。 由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数不同而实现，避免了因不可逆吸附而引起的样品失活、损失、变性等，不仅能使样品全部回收，更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。 具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。 5、检测 紫外-可见光检测器 单波长、多波长UV-VIS 制备型HPLC的检测器 （检测池：直形的垂直流通型的。因为分析型HPLC的U形检测池容易使固定相液滴滞留在池中，引起检测器噪声。） 避免措施：轻相流动相从检测池上端进入，向下流出； 重相流动相从检测池下端进入，向上流出。 蒸发光散射检测器 傅里叶红外光谱检测器 （HSCCC获得高的溶质-溶剂比的流出物，使流动相吸收红外光谱的问题得到解决。） 薄层色谱检测器（样品喷雾装置） 质谱检测器 五、仪器结构 分析型 制备型 方法应用 分析型HSCCC的应用 溶剂体系的快速筛选 利用分析型HSCCC体积小、速度快、溶剂消耗小的特点。 例：Pharma-tech的CCC-20分析型逆流色谱仪（柱体积43mL） Ito制备型多层螺旋管分离仪（柱体积280mL） 沙棘黄酮的分离 分析型HSCCC上样量3mg，分离过程15min； 制备型HSCCC上样量100mg，分离过程2.5hr。 葛根异黄酮的分离 分配系数的测定 在CCC中，由于溶质的分配系数可以从色谱图中计算而得，因此可以作为一种新型的测定分配系数的方法。 例：系列烷基苯在正庚烷-甲醇-水体系中的分配系数 小量天然产物样品的分离 粗样或其它复杂样品可以直接进样而不需要预先处理，样品也不会因为不可逆吸附而损失。 例：多酚类物质的分离。 这类物质在HPLC上容易与色谱柱上的固体填料之间产生相互作用，而导致拖尾。在硅胶柱上易发生不可逆吸附。 HSCCC被认为是分离多酚类物质最有效的手段。 例：植物粗提物的分离纯化。 很好的样品富集和预处理的手段。 分析型HSCCC作为一种为制备型HSCCC进行方法开发和小量样品的分离纯化手段，会有较好的应用前景。 中药指纹图谱研究方面的应用 在不可能将中药复杂成分都搞清楚的情况下，指纹图谱的作用是反映复杂成分的中药及其制剂内在质量的均一性和稳定性。 HSCCC相对于其他色谱技术具有许多独特有点。 应用领域与拓展 双水相逆流色谱在蛋白质分离纯化中的应用 离心沉淀色谱在蛋白质等分离中的应用 逆流色谱在手性分离中的应用 逆流色谱在天然药物工业中的应用 双水相逆流色谱在蛋白质分离纯化中的应用 双水相体系（aqueous two-phase system, ATPS） 是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相系统。 通过溶质在两相间分配系数的差异而进行分离的方法称为双水相萃取技术。 最常见：聚乙二醇（PEG）-磷酸盐水溶液体系 聚乙二醇（PEG）-葡聚糖（DEX）体系 成功用于蛋白质的大规模分离中。 离心沉淀色谱在蛋白质等分离中的应用 色谱分离是依据被分离物在两相中分配系数的不同而进行； 逆流色谱是利用物质在两相液体中分配系数的不同实现分离； 分离也可以依据被分离物在一个含有沉淀剂的浓度梯度变化的单一溶剂中的溶解度的不同而实现。 （前提：沉淀剂浓度梯度移动的速度远低于溶剂流速） 溶解度具有很小差异的物质，经过在柱中反复的沉淀和溶解即可达到分离。 离心沉淀色谱（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一种建立在类似于逆流色谱的不用固体支撑体的开放性通道基础上的沉淀和溶解色谱。 具有一定浓度梯度的沉淀剂通过半透膜引入柱中，沉淀的样品分子通过离心力保留在柱中。 克服了传统色谱中由固体支撑体引起的样品损失及柱子堵塞等问题。 应用于蛋白质和一些合成高聚物的分离。 原理： 由一层半透膜隔开的一对通道构成的分离柱系统。 上层：高浓度沉淀剂硫酸铵溶液 下层：水 ? 形成沉淀剂浓度梯度 将一个混合样品引入到下层通道，所有组分根据溶解度不同逐步沉淀下来； 降低上层沉淀剂浓度开始分离洗脱。 蛋白质分离条件的优化  逆流色谱在手性分离中的应用 逆流色谱的优势 独特的高制备能力、低廉的液态固定相和低溶剂消耗； 不需要采用化学手段将手性试剂键合到固体介质上，只需将其