质粒DNA的小量制备剖析.pptVIP

4）将细菌沉淀重悬于100?l 4℃预冷的溶液I中，盖紧管口，vortex剧烈振荡，使细菌沉淀完全分散，放置5-15min。 5）加200?l溶液II，盖紧管口，快速颠倒Eppendorf管5次，使管整个内表面均与溶液II接触（不要振荡），冰上放置5-10min。 6）加入150?l 4℃预冷的溶液III，盖紧管口，温和振荡10sec，冰上放置5min。 7）4℃离心15000rpm?5min，将上清转移至另一EP管中。 8）加入等量酚-氯仿-异戊醇，振荡混匀，于4℃离心15000rpm?2min，将上清转移至另一EP管中。 9）加入等量氯仿，振荡混匀，于4℃离心15000rpm?2min，将上清转移至另一EP管中。 10）加入2倍体积无水乙醇，振荡混匀，室温放置5min（或-70℃放置30min），4℃离心15000rpm?10min，小心吸去上清，将附于管壁的液滴除尽。 11）用4℃预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀1-2遍，按上述方法除尽上清，37℃干燥5-10min。 12）用含RNase的TE或H2O溶解DNA，贮存于-20℃。 许多公司都研制出成套的商品化质粒提取试剂盒，原理大都依照碱裂解法，但在纯化步骤上采用柱层析，实验步骤参考相应的Protocol。 * 微量加样器的使用方法 3、将吸头浸入待移取的液体液面下2-3mm处，慢慢松开按钮，液体在大气压的作用下进入吸头内。待吸入要求量的液体后，将加样枪撤离液面，擦去吸头外侧的液体，注意不能接触吸头尖部。 1、将加样枪刻度或读数调至所需定量吸取的液体量值，并装上合适的吸头。 2、将按钮压至第一停点位置（有明显的阻滞感）并保持，以挤出吸头内空气，形成吸头内负压。 * 5、继续按住按钮，撤出加样枪，将吸头弃于特定的盛污染吸头的器皿中，松开按钮至起始位置，将加样枪竖直悬挂在加样枪架上。 4、将加样枪移至待加入液体的容器，让吸头位于容器液面的近上方。轻轻压下按钮至第一停点位置，让液体缓缓流出。待液体将流尽时，继续将按钮下压至第二停点位置，并让吸头尖部轻轻接触液面上方的容器壁，以免产生气泡。 * 2、要保证在整个吸液过程中，吸头尖端要一直处于液面之下，即防止吸空造成吸样不准确。 1、加样前，一定要检查吸头是否上紧，以免液体漏出或取液不准。 3、吸取液体完成后排出液体之前，一定要擦去吸头四周的液体，特别是在取液量较少时尤其要注意这一点，但要防止接触吸头尖端。 注意事项： * 5、排出液体时，在液体将排尽时，要轻轻让吸头尖端接触容器壁，以免在加样的容器中形成气泡。 4、吸取液体和排出液体动作都一定要慢，因为动作过快时，液体因表面张力吸附在吸头壁上，造成移液不准。所取液体的粘度越高，越应该注意这个问题。 * 6、加样完成后，应在弃去使用过的吸头后，方才松开按钮至起始位置，以免吸头内的残留液体回吸到枪头，造成交叉污染。 7、注意使用一次性吸头，避免交叉污染。 8、如不使用，要把加样枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。。 * 一、实验目的及要求 二、实验设备及要求 三、实验内容与步骤 四、实验结果与数据处理 五、分析与讨论 实验报告的内容 * 提质粒步骤 1.室温10000xg 1min 离心收集菌体 2.加入250ul SolutionI/RNase A 充分重悬菌体 3.加入250ul SolutionⅡ并轻柔颠倒混匀多次直到液体清亮。2min室温孵育。 4.加入350ul SolutionⅢ并颠倒离心管多次使充分混匀，直到有白色絮状沉淀产生。 5.室温，≥13000xg，15min离心 6.小心吸取上清到HiBind柱中（每次700ul），室温，10000xg，1min离心，直到所有上清都过了柱 7.加入500ul Buffer HB 去洗HiBind柱，室温，10000xg，1min离心。 8.加入700ul DNA Wash Buffer（已加入无水乙醇），室温，10000xg，1min离心。 9.Repeat8 10.空柱，≥13000xg，2min离心。 11.室温晾柱1-2min，加入30ul-50ul Elution Buffer（注意要加到白膜上），将柱子放到1.5ml离心管，≥10000xg，1min离心收集DNA。 基因工程实验模块 一、质粒DNA的提取和鉴定 二、目的基因的获得和重组载体的构建 三、感受态细胞的制备、转化及重组子筛选 四、目的基因在E.coli中表达与SDS鉴定 一、质粒DNA的提取和鉴定 实验一、质粒DNA的小量制备 实验二、质粒DNA的电泳鉴定 实验三、质粒DNA的酶切 质粒(plasmid)的基本概念： 1）是生物细胞内固有的、 能独立于染色体而自主复 制、并被稳定遗传的核酸 分子。