NY_T553-2015禽支原体PCR检测方法.docVIP

ICS 11.220B41 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 553—2015 代替 NY/T 553—2002 禽支原体PCR检测方法 Detection of avian mycoplasmasby polymerase chain reaction(PCR) 2015-05-21 发布 2015-08-01 实施 中华人民共和国农业部发布 刖 本标准按照GB/T 1. 1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T 553—2002《禽支原体病诊断技术》。 本标准与NY/T 553—2002相比，删除了血清凝集实验，选取了 PCR方法检测鸡毒支原体和滑液 囊支原体。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口。 本标准起草单位:中国动物卫生与流行病学中心。 本标准主要起草人:王娟、李卫华、王玉东、黄秀梅、龚振华、郭福生。 本标准的历次版本发布情况为： ——NY/T 553—2002。 禽支原体PCR检测方法 1范围 本标准规定了禽支原体PCR(聚合酶链式反应)的检测技术要求。 本标准适用于禽支原体病的流行病学调查和辅助性诊断。 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 MG： mycoplasma gallisepticum 鸡毒支原体。 MS：mycoplasma synoviae 滑液囊支原体。 YSS-.phosphate buffered solution 憐酸盐缓冲液。 3实验室设备要求 3.1仪器 基因序列分析仪、台式高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像系统、微量移液器、水 浴锅、涡旋仪等。 3.2操作区域 样品处理区要有相应的生物安全设施;配液区要求高度洁净;电泳区要与其他操作区域相互隔离。 3.3操作者 操作者应接受过PCR技术培训，熟悉防止核酸污染和溴乙锭污染的具体措施，熟悉电泳结果的判 断方法。 4相关试剂 1 2 X Taq Master Mix 生物试剂公司生产。 1.5 %琼脂糖凝胶 见 A. 1 ^ 3 1XTAE缓冲液 见 A. 2。 溴乙锭（10Mg/ML) 见 A. 3。 5商品化的DNA分子量标准 要求在100 bp?300 bp之间有5条以上的指示条带。 4.6标准菌株 S6株、WVU1853株购自中国兽医药品监察所。 4.7阴性对照品 用高压灭菌的PBS作为阴性对照标准品。 5操作程序 5.1样品处理 将气管拭子、关节囊穿刺液、关节面拭子样品悬浮于1 mL PBS溶液中，混匀成悬浮液;气管、肺、气囊 等组织器官充分研磨后，加入适量的PBS溶液，制成混悬液，备用;也可用分离培养后的菌液作为样品。 DNA提取 将制成的悬浮液或悬液2 000 r/min离心5 min，将离心后的上清或分离培养后的菌液置于1. 5 mL 带盖的微量离心管中，在4°C条件下，14 000 g离心30 min。用微量加样器仔细除去上清液，并将沉淀悬 浮于25 pL双蒸水中。将置于离心管中的内容物隔水煮沸10 min，然后冰浴10 min，14 000 g■离心 10 min，上清液为DNA模板，用于扩增其16 S rDNA。 5.3引物 3. 1 mg引物序列 MG - 14F: 5，- GAG CTA ATC TGT AAA GTT GGT C - 3,； MG - 13R: 5，- GCT TCC TTG CGG TTA GCA AC - 3’。 MS引物序列 MS-F: 5，- GAG AAG CAA AAT AGT GAT ATC A - 3’ ； MS-R: 5- CAG TCG TCT CCG AAG TTA ACA A - 3’。 PCR反应体系 25(LtLPCR反应体系包括: ddH20 9. 5 f/L DNA 模板 2.0ML 2 XTaq Master Mix 12. 5 juL 上、下游引物混合物 1.0 (uL 每次试验应设阳性对照和阴性对照。 先94°C变性5 min，然后按94°C变性30 s、55°C退火30 s、72°C延伸60 s的顺序循环，共循环35次， 最后在72°C温度下延伸10 min，于4°C保存，备用。 5 PCR产物电泳 PCR反应结束后，每个PCR管中加人5 juL加样缓冲液，充分混匀，再每管取5 pL加人琼脂糖凝胶 板的加样孔中，在位于凝胶中央的孔加入DNA分子量标准。加样后，按照5 V/cm电压，电泳20 min? 40 min(每次电泳时，每隔10 min观察1次。当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下2/5处时，可停 止电泳）。电泳后，置于紫外凝胶成像仪下观察，用分子量标准判断PCR扩增产物大小。 6结果判定 阳性对照出现相应大小的扩增条带，且阴性对照无此扩增带时，判定