酶学分析技术一剖析.pptVIP

第五章　 酶学分析技术 * 酶（enzyme）的本质： 高度特异性、高度不稳定性，高效性、可调节性 酶的应用： 由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂 酶的特点： 酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临 床诊断和疗效判断 * 主要内容： 酶活性测定的基本知识 酶活性的测定 代谢物的酶法检测 同工酶测定 * 掌握酶活性单位的表示方法与计算、酶活性测定的定时法与连续监测法、代谢物的酶法测定。 熟悉酶促反应进程、酶促反应动力学、酶活性测定的直接法与间接法、酶活性测定的影响因素。 了解同工酶产生的机理与测定方法、酶活性单位的校准、工具酶的应用。 教学要求： * 第一节 酶活性测定的基本知识 酶测定 绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法 相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法 E E * 简介内容： 一、酶活性 二、酶活性单位与酶活性浓度 三、酶促反应进程 四、酶促反应动力学 * 一、酶活性 定义：酶活性（enzyme activity）也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。 表示方法： 　 　或　 式中v：反应速率，[P ]：产物浓度，t：时间，[S]：底物浓度。 * 二、酶活性单位与酶活性浓度 （一）酶活性单位 定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内 生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。 表示方法： 惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间） 国际单位IU（μmol/min） Katal单位（mol/s） * 1．惯用单位： 20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位 ALP的金氏单位（King） 氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen） 特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较少。 卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.82 ? 10-4μmol NADH为一个卡门氏单位 举例： 金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。 * 2.国际单位IU（μmol/min） 定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1μmol 底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1μmol/min。 IFCC,2001年 37℃ 3．Katal单位 定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的 酶量。1Katal＝1mol/s。 IU与Katal单位的关系：1katal = 60×106IU，1IU = 16.67nkatal * （二）酶活性浓度 酶的含量严格说是指酶分子的质量浓度（g/L,mg/L）,但人体内酶的含量很微量（ug/L）,常规测定很困难。 酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位。国际单位用IU/L或U/L表示。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性. * * 酶蛋白质量浓度表示法 免疫学方法：利用酶蛋白分子具有抗原性的特点，可以通过抗原-抗体反应的原理直接测定酶的质量（ng/L,ug/L）. 优点： 灵敏度高 可测定少量酶或者痕量酶 特意性高 不受体液中其他物质影响，如酶抑制剂，激活剂等 测定不表现活性的酶蛋白 如酶原，去辅基酶蛋白，无活性的酶蛋白 同工酶测定 缺点： 需要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清 测定步骤多，操作繁琐 成本高 三、酶促反应进程 以产物生成量（或反应物减少量）为纵坐标、反应时间为横坐标作图所得到的一条曲线，称为反应进程曲线（或反应时间曲线、速率曲线、时间曲线） t1 t2 　　 时间t 图5-1　酶促反应进程曲线 吸光度A 延滞期 线性期 非线性期 * （一）延滞期（lag phase、延迟期 ） 特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟 t1 t2 　　 时间t 图5-1　酶促反应进程曲线 吸光度A 线性期 非线性期 R1 R2 延滞期 孵育期 延滞期 * （二）线性期