固定化酶和固定化细胞讲述.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 固定化酶不同方法的比较 4.4 固定化酶的特性 4.4.1 固定化酶的形状 颗粒和线条主要用于工业发酵生产； 薄膜主要用于酶电极，应用于分析化学； 酶管机械强度较大，宜用于工业生产。 4.4.2 固定化酶的性质 固定化酶分子状态从游离的状态变为牢固地结合于载体的状态，其结果往往引起酶的性质的改变。 （1）酶活力 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是： ① 酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合； ② 当酶与载体结合时，其构象的改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变； ③ 酶被固定化后，虽不失活，但酶与底物间的相互作用受到空间位阻的影响。 个别情况下，酶经固定化后其活力升高，可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高。 （2）固定化酶的稳定性 固定化酶的稳定性增强主要表现在： （1）操作稳定性 （2）贮藏稳定性 （3）热稳定性 （4）对蛋白酶的稳定性 （5）酸碱稳定性 ① 底物特异性 当酶的底物为小分子化合物时，固定化酶的底物特异性大多数情况下不发生变化。而当酶的底物为大分子化合物时，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。 酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底物特异性的影响也不同，一般随着底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。 （3）固定化酶的反应特性 ② 反应的最适pH 酶被固定后，其最适pH和pH曲线常会发生偏移，原因可能有三个方面： 一是酶本身电荷在固定化前后发生变化； 二是由于载体电荷性质的影响致使固定化酶分子内外扩散层的氢离子浓度产生差异； 三是由于酶催化反应产物导致固定化酶分子内部形成带电荷微环境。 ③ 反应的最适温度 固定化酶的最适反应温度多数较游离酶高，会受固定化方法以及固定化载体的影响。 ④ 米氏常数 使用载体结合法制成的固定化酶Km有时变动，主要是由于载体与底物间的静电相互作用的缘故。Km值还与载体颗粒大小有关，载体颗粒越小， Km值在固定前后变化越小。 ⑤ 最大反应速度 固定化酶的最大反应速度与游离酶大多数是相同的。有些酶的最大反应速度会因固定化方法的不同而有所差异。 4.4.3 固定化酶性质改变的因素 （1）微环境的影响 （2）扩散限制、分配效应的影响 （3）立体屏蔽的影响 （4）酶分子构象改变、化学改变的影响 扩散限制效应： 酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散限制： 1）外扩散限制是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。 2）内扩散限制是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散限制的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散限制。 分配效应 由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。 由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。 立体屏蔽 固定化后由于载体空隙太小，或固定化的结合方式不对，使酶活性中心或调节部位造成某种空间障碍，使效应物或底物与酶的邻近或接触受到干扰，不易与酶接触。 固定化细胞的优越性： ① 无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本； ② 可进行多酶反应，不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用菌体中所含的复合酶系完成一系列的催化反应； ③ 对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强； ④ 细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快。 4.5 固定化细胞 固定化细胞的缺点： 必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度； 必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解； 胞内多酶的存在，会形成副产物； 载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍。 固定化细胞的分类 按细胞类型分：固定化微生物细胞、固定化植物细胞、固定化动物细胞 按细胞生理状态分：固定化死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器）、固定化活细胞（增殖细胞、静止细胞、饥