基因重组解说.pptVIP

第一节原核微生物的基因重组  特点：片段性，单向中性，转移机制独特而多样 形式：转化、转导、接合和原生质体融合几种形式。 一、转化（transformation）  受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它整合到自己的基因组中，再经复制就使自己变成一个转化子。这种受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象，就称转化。 能进行转化的受体细胞必须处于感受态，即受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。 　 　 (一)、几个概念 转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。 转化子：通过转化方式而形成的杂种后代。 转化因子： 起转化作用的供体细胞DNA片段称为转化因子 。 一般15kb左右。 感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。 相关因素：菌种类、培养时间、特异蛋白(DNA结合蛋白、胞壁自溶素、核酸酶)。 转染：用提纯的病毒核酸去感染其宿主细胞或原生质体，可增殖出一群正常病毒的现象。 （二）转化DNA的特点 1 转化子数目与DNA浓度的关系 P65 图5－9 2 DNA片段的大小与转化子数目的关系－－相对分子质量在4×106以下（单链） 3 单双链与转化活性的关系－DNA链完整的双链结构 4 转化DNA的命运 （三）受体细胞的特点 1 受体细胞的感受态 肺炎链球菌的感受态在对数期 枯草杆菌的感受态出现在对数期后期、稳定期前期。 2 感受态的比例和细胞间转移（肺炎链球菌和嗜血杆菌、枯草芽孢杆菌） 3 感受态因子（5000－10000左右的蛋白质） （四）枯草杆菌感受态和非感受态的生理区别 （1）感受态的发生是一个发育过程 （2）密度不同（密度梯度离心区分感受态与非感受态） （3）抗原性不同 转化过程示意图 转化频率：0.1%~1%， 最高为20%。 最低DNA浓度： 1*10-5μg/mL 转导噬菌体为什么“错”将 宿主的DNA包裹进去了呢? 研究表明，这与噬菌体的包装机制有关。 P22噬菌体DNA的包装机制：进入细胞的P22DNA经环化(冗余末端之间重组)和滚环复制形成一个多联体(co ncatemer)分子。DNA的包装从基因组的一个特殊位点(pac,package)开始，用噬菌体编码的酶按顺序进行切割，并以“headful”的长度进行包装，与此同时，该酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳，形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒。但这种“错装”机率很小(10-6-10-8)，因为染色 体上的pac与P22 DNA的pac序列不完全相同，利用效率较低。 　 　 接合作用（conjugation) 　 　 　 　　 　 　 　　 有性杂交 准性生殖分为 4个过程 ： 1、菌丝联结:发生在同种不同菌株的体细胞间(单倍体) 2．形成异核细胞：具有不同性状的两个体细胞互相连接，进行质配，两个不同基因型的核独立存在。 这样的菌丝体称为异核体。 3．核融合：异核体中不同基因型的2个核有少数可发生细胞核融合，进行核配，形成二倍体核。 异核细胞不够稳定，二倍体细胞较为稳定。 4．体细胞交换和单倍体化 二倍体虽然比较稳定，但稳定性是相对的，其后代仍有一些分离现象。通过分离，可获得少数分离子。 准性杂交 （二）载体的选择 理想的载体应具备的特征： （1）能在宿主细胞中独立复制，或者能有效地协助外源基因整合到宿主染色体上，使外源基因可以随宿主染色体一起复制； （2）容易进入宿主细胞； （3）有一定的选择性标记，易于识别和筛选； （4）可插入一段较大的外源DNA，而不影响其本身的复制； （5）有合适的限制酶位点便于进行克隆。 （6）具有较好的安全性、易制备、多拷贝、易于表达等特点。 第4章作业 1、原核生物基因重组的主要形式。 2、转化、转导、接合、原生质体融合的概念 3、PCR技术的实验操作过程。 （一）接合实验(conjugation) 中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！ 接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导 F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛（sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。 在细菌中，接合现象研究得最清楚的是大肠杆菌的接合 含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛 不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛 （二）接合作用(conjugation) F因子为附加体，质粒既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上 （三）接合本质(conjugation) F F因