westernblot蛋白质印迹材料.ppt

操作步骤 5.将转移池中注满电转液，将转移槽置于冰水中，打开电源，转移电压：长X宽X0.8，1-2小时 操作步骤 检测 1.封闭：将膜小心取出后用蒸馏水冲洗，放入封闭液（3%的BSA）中封闭1小时，同时将胶染色 2.洗涤：用洗涤液洗涤3—5次，每次10分钟。 3.结合一抗：用1%的BSA封闭液10000倍稀释一抗，37度孵育1小时 4.洗涤：同上洗涤3—5次，每次10分钟。 5.结合二抗：用1% 的BSA稀释二抗10000倍，37度孵育1小时 6.洗涤： 同上用洗涤液洗3—5次，每次10分钟 7.显色：用Amersham的ECL显色底物，分别取1ml 2ml溶液混合，涂于膜上 * * 免疫印迹 Western Blotting Western Blotting 免疫印迹 主要内容：一、印迹的概念和分类二、印迹的流程三、免疫印迹过程四、免疫印迹技术的应用 二、印迹的流程 探针 固相载体 印迹 封阻 探针作用 显色或自显影 三、免疫印迹过程 细胞裂解液→样品在凝胶上电泳→分离好的蛋白质转移到膜上→封闭非特异性位点→与特异性抗体一起温育→与检测试剂一起温育 →显色（HRP、AP法) →化学发光(HRP、AP法) Flow Chart of Western blotting Electrophoresing the protein sample Assembling the Western blot sandwich Transferring proteins from gel to nitrocellulose paper Staining of transferred proteins Blocking nonspecific antibody sites on the nitrocellulose paper Probing electroblotted proteins with primary antibody Washing away nonspecifically bound primary antibody Detecting bound antibody by horseradish peroxidase-anti-Ig conjugate and formation of a diaminobenzidine (DAB) precipitate Photographing the immunoblot (一)样品凝胶电泳 SDS polyacrylamide-gel electrophoresis Analysis of protein samples by SDS polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting Protein bands detected by specific antibody SDSWestern blot (二)转移(transfer) 电泳转移(Electrophoretic transfer):湿转(tank transfer)、半干转移(semi-dry transfer) 微滤点膜(microfiltration) 蛋白质转移系统(protein transfer systems) The Trans-Blot Plus Cell. 1.buffer tank and lid; 2.gel holder cassette and fiber pads; 3. Plate electordes; 4. Super cooling coil. (三)膜的种类和选择 Nitrocellulose PVDF(polyvinylidene difluoride,聚偏二氟乙烯） (四)免疫检测 显色（HRP、AP法) 化学发光(HRP、AP法) 操作步骤 lSDS灌胶 12%分离胶： H2O 2.45ml 30%丙稀酰胺 3ml 1.5M Tris-cl 1.9ml 10%SDS 75ul 10%过硫酸胺 75ul TEMED 8ul 7.5ml 操作步骤 lSDS灌胶 5%浓缩胶 H2O 3.4ml 30%丙稀酰胺 830ul 1 M Tris-cl 630ul 10%SDS 50ul 10%过硫酸胺 50ul TEM