实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶 - 副本.pptVIP

琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶 实验目的 掌握：电泳法测定血清乳酸脱氢酶同工酶的基本原理。 熟悉：电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶的的操作过程、注意事项及对疾病诊断的临床意义。 了解：琼脂糖凝胶电泳的临床应用。 　　　乳酸脱氢酶同工酶的一级结构和等电点不同，在一定的电泳条件下，使其在支持介质上分离。然后利用酶的催化反应进行显色： 1．巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.075） 2．0.082mol/L巴比妥-盐酸缓冲液（pH 8.2） 3．10mmol/L乙二胺四乙酸二钠 4．5g/L缓冲琼脂糖凝胶 5．8g/L缓冲琼脂糖凝胶 6．显色试剂 7．固定漂洗液 1．制备琼脂糖凝胶玻片 2．加样 用微量加样器加约40μl血清于槽内。 3．电泳 电压75V～100V，电泳30min～40min。 4．显色 5．固定和漂洗 1．目视观察 在碱性介质中，LD同工酶电泳条带由正极到负极依次为：LD1、LD2、LD3、LD4和LD5。按各区带呈色的深浅，比较LD各同工酶区带呈色强度的关系。 2．光密度计扫描 用光密度计在570nm波长下扫描，求出各同工酶区带吸光度所占百分比。 3．在不具备光密度仪扫描条件下，如果需要进行定量，可将各区带切开，分别装入试管中，加入400 g/L尿素 4ml，于沸水浴中加温5 min～10min，取出冷却后以570nm波长比色。 空白管则取大小相同但无同工酶区带的凝胶，用上述相同的方法处理。 比色后根据各管吸光度计算各同工酶的百分率。 吸光度总和：A总＝A1+A2+A3+A4+A5， 式中A1、A2、A3、A4、A5为各同工酶区带的吸光度 各同工酶百分率(%)为： 　　　　　　　　　　　(x=1，2，3，4，5 ) 　健康成年人血清中LD同工酶百分比 有下述规律：LD2＞LD1＞LD3＞LD4＞LD5。 1. LD同工酶电泳分析在临床上常用于急性心肌梗死的诊断，在急性心肌梗死时LD1与LD2活性均升高，但LD1升高更早、更明显，导致LD1/LD2比值增大。 2. 溶血性疾病、幼红细胞贫血症、肾坏死、以及假性肥大性肌营养不良、活动性风湿性心肌炎、急性病毒性心肌炎患者血清LD1和LD2的活性也可增高。 3. 肝炎、急性肝细胞损伤时LD5增高。急性肺损伤、白血病、胶原病、心包炎以及病毒感染时LD2和LD3增高。 4. 胃癌、结肠癌和胰腺癌患者血清中五种LD同工酶均可升高，但以LD3增高最为显著。骨骼肌损伤时LD4和LD5增高。 1．严禁溶血。 2．LD4与LD5（尤其是LD5）对热很敏感，因此底物-显色液的温度不能超过50℃，否则易使LD5等变性失活。 3．LD4和LD5对冷不稳定，容易失活，应采用新鲜标本测定。如果需要，血清应放置于25℃条件下保存，一般可保存2d～3d。 4．PMS对光敏感，故底物显色液需避光保存，否则显色后凝胶板背景颜色较深。 1．LD同工酶测定时为什么要严禁溶血？为何测定LD的血清标本不能冰冻或冷藏？ 2．LD同工酶测定对疾病诊断的临床意义为何优于LD总活性测定？ 3．LD同工酶琼脂糖电泳测定的原理是什么？在电泳中应注意哪些事项？ * * 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） * 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶 苏州大学附属第二医院 检验科 　 王冰莹 实验原理 试剂与器材 操作步骤 结果观察 结果观察 计算 参考范围 临床意义 临床意义 注意事项 思考题