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第一章 DNA及RNA实验 第一节 组织和细胞RNA的制备 样品处理： 培养细胞：收获细胞×106，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。 （3）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃ 及液氮中保存的均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置5min。 加入0.2ml氯仿，震荡15s，静置2min4℃离心，12000rpm×15min，取上清。 加入0.5ml异丙醇(或与上清等体积），将管中液体轻轻混匀，静置10min4℃离心，12000rpm×10min，弃上清。 加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500 rpm×5min，弃上清。 6、在室温中放置10min晾干，加入适量的DEPC水溶解（65℃促溶10-15min） 注意事项和Trizol的加入量一定要按步骤1的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会是内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。℃中。 3、实验过程必须严格防止RNase的污染。要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。试剂制备75%乙醇（DEPC配制）DEPC水 第二节 逆转录PCR 【使用Fermentas ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit】 1、取RNase-free的0.2微量离心管，冰上依次加入下列试剂的混合物至管中： 试剂 体积(l） 总RNA（0.1-5ug） X Oligo(dT)18 primer （0.5 (g/(l） 1.0 RNA-free H2O Y X+Y=11 (l，温和混匀孵育5 min后迅速置于冰上。 5× reaction buffer 4.0 10 mM dNTP Mix 2.0 RiboLockTM Ribonuclease Inhibitor 20 U/(l） 1.0 RevertAidTM M-MuLV ReverseTranscriptase （200 U/(l） 1.0 温和混匀42 ℃反应60 min，70孵育10 min终止反应，冰上冷却。 注意事项 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNAde完整性。 实验中所有物品都应避免RNA酶的污染。操作过程中均应戴手套。 ’端不能被封闭，3’端无较长的自身发卡结构（大于2个）； 3、引物总长度最好不要超过40bp，特殊引物除外； 二、基因克隆引物的设计： 1、引物设计使用Primer Premier 5.0软件(简称PP 5.0)进行； 2、首先将克隆的基因序列拷贝至PP 5.0软件中，保证所克隆基因的起始密码子位于30bp之后（即31bp开始为ATG。。。），基因的末端保证在终止密码子之后依然有超过20bp的延伸序列； 3、点击Enzyme选项进行酶切分析，找到不能切割序列的酶（Non-cutters），从中选择较为常用的两个酶（如Hind3、EcoR1、Xho1、BamH1和Kpn1等）进行克隆，同时注意此酶必须在目的载体的多克隆序列内； 4、点击“primer”进行引物设计，先设计正向引物，将“S/A”选钮点至“S”，将引物序列固定至所需要克隆的起始端，点击“edit primers”，减去数个碱基后点击“prime”进行引物分析，观察引物的Tm值（60-70℃）、GC比例（40-60%），尽量符合此条件； 5、在5’端加上酶切序列，在酶切序列和配对序列之间斟情加减碱基以防止错码，在酶切序列之前添加3个保护碱基，保护碱基的序列可参考“NEB限制性内切酶保护碱基表”或以个人习惯而定，最后将序列拷贝出； 6、反向引物设计时，先将“S/A”点至“A”，同理进行设计，注意反向引物如果后续有标签序列，不能将终止密码子设计入引物中； 三、普通PCR引物设计： 普通PCR引物长度在18-22bp之间，引物需要跨内含子（即不同引物需要在不同的外显子之上），GC比例在40-60%之间，利用PP5.0分析上下游引物的退火温度在55-60℃左右，所PCR产物长度在100-250bp之间。 第四节 目的基因基因克隆及PCR 一、 实验原理 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,