酶与细胞的固定化教材.pptVIP

固定化细胞类型： 生理状态 载体结合法 交联法 包埋法 载体活化的方法： 载体上的偶联功能基团：芳香氨基、羟基、羧甲基和氨基 酶分子功能基团：氨基、酚羟基、咪唑基、巯基、酚基和羟基等。 重氮法：将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团。 迭氮法：含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成迭氮化合物。 溴化氰法：含有羟基的载体，如纤维素、琼脂糖凝胶等，可以用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物。 烷化法：含羟基的载体可以用均三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。 优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不会轻易脱 落，可以连续使用。 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，反应条件激烈，可能会破坏活性中心，催化效率低。 保护措施：1）选择适宜的固定方法和载体；2）严格控制反应条件，提高反应的专一性；3）应用可逆抑制剂或底物，封闭酶的活性中心。 交联反应可能发生在酶分子之间，也可能发生在分子内。 与酶的浓度与交联剂的浓度，也与pH和离子强度有关。 低酶浓度下主要形成分子内交联，保持溶解状态；高浓度下，分子间交联比例上升，变为不溶状态。 辅酶物质的固定化方法 辅基的固定化 载体共价偶联法：琼脂糖，纤维素及高分子载体等。 辅酶的固定化 载体共价偶联：溴化氰 辅酶的再生 辅酶和酶共固定的反应系统 辅酶与酶分子偶联形成辅酶-酶复合物的反应系统 5.2 固定化酶和固定化细胞的性质与表征 酶的活性 与酶的种类，反应系统的组成，固定化方法以及固定化载体的不同而变化。 影响酶催化活性的主要因素： 构象改变：固定化过程中酶和载体的相互作用，引起酶的活性中心/调节中心构象改变，从而导致酶活性改变的一种效应。 立体屏蔽：由于载体的孔径太小，或是由于固定化的方式与位置不当，给酶的活性中心/调节中心造成了空间障碍，底物无法直接和酶接触，从而影响了酶活性的一种效应。（大孔径胶，连接臂） 微扰：固定化载体的亲水，疏水性质与介质的介电常数等直接或间接酶的催化能力。 分配效应：固定化载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物以及其他效应物在微观环境与宏观环境间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速度的一种效应。（和固定化酶紧邻的微观局部环境） 扩散限制效应：指底物、产物以及其他效应物的迁移和运转速度受到限制的一种效应。 稳定性: 较高的稳定性，较长的操作寿命和保存寿命。 主要表现在: 1）酶的耐热性增加（提高反应温度，加快反应速度） 2）对变性剂，抑制剂的抵抗能力增强（在有机溶剂中进行反应） 3）减轻了蛋白酶的破坏作用 4）增强储存稳定性和操作稳定性（半衰期） 最适温度：固定化酶的最适作用温度一般比游离酶提高。 最适pH值：常会发生一些变化，主要受载体带电性质的影响。（负电荷载体，其最适pH上升） 底物特异性：与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。 酶的动力学特征：表观米氏常数随载体的带电性能变化，受溶液中离子强度影响大。（异种电荷在固定化酶微环境中的浓度比整体溶液的高，Km降低）。 5.2.3 固定化酶（细胞）的评价指标 1. 酶/细胞的活力 一定条件下由它催化的某一反应初速度来表示。 （每毫克干重固定化酶每分钟转化底物的量） 间歇测定：在搅拌或震荡反应器中，与溶液酶同样测定条件下进行，间隔一定时间取样，过滤后按常规酶活测定方法。 连续测定：将固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液。根据流速和反应速度之间关系，算出酶活力。 2. 蛋白总量 检测固定化的酶蛋白的量 双辛可宁酸法（BCA法） 考马斯亮蓝法 3. 偶联率及相对活力 4. 半衰期 在连续测定的条件下，固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间。 5.3 固定化酶与固定化细胞的应用 固定化酶在医药上的应用 自然酶缺点： 1）引起免疫反应 2）易被蛋白水解酶降解 3）被稀释 措施： 1）可溶性载体修饰：延长半衰期和避免免疫过敏反应。 2）凝胶包埋：缓释作用。 3）脂质体包埋：定向。 5.2.1固定化酶的性质 活性：多数情况下固定化酶活力常低于天然酶；有可能不影响；有时升高。 稳定性: 主要表现在对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度；保存稳定性好，可以保存较长时间；对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解；对变性剂的耐受性提高。 最适温度：固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，但有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有明显的变化。 最适pH值：常会发生一些变化，主要受载体带电性质和酶催化反应产物性质的影响 底物特异性：与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物