等电点电泳原理步骤详细说课.pptVIP

等电聚焦电泳Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE 讲课内容 一、IEFE 定义 IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等电点（isoelectric point，pI)不同的蛋白质的电泳技术。 Isoelectric focusing (IEF), is a technique for separating different molecules by their electric charge differences.  等电聚焦(Isoelectric focusing ,IEF)就是在电泳介质中放入载体两性电解质(Carrier ampholyte)，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。 讲课内容 二、IEFE的特点 （一）优点 High Resolution High Sensitivity Good Reproduction （二）缺点 1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀。 2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不溶或发生变性的蛋白质。 分辨率(resolution)较不连续PAGE更高，特别适合于分离分子量(molecuar weight,MW)相同而电荷(electric charge)不同的生物大分子。 讲课内容 三、IEFE的基本原理 蛋白质分子在不同pH下的解离状态 NH3+ NH3+ NH2 P P P COOH COO- COO- pH＜pI pH＝pI pH＞ pI 在电泳介质中放入载体两性电解质(carrier ampholytes) ，当通入直流电时，两性电解质形成一个由正极(anode)到负极(cathode)逐渐增加的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。 蛋白质分子的电聚焦过程 + pI1 pI2 pH=pI pI3 pIn - a b c 蛋白质分子在负极端 蛋白质分子在正极端 蛋白质样品中各组分聚焦成区带 在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。 The proteins become focused into sharp stationary bands with each protein positioned at a point in the pH gradient corresponding to its pI . 进行IEFE必须具备3个条件： ①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度 ②有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合 ③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带 （一）pH梯度的建立 用多种两性电解质(ampholytes)混合物建立稳定良好的pH梯度 1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征： ①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； ②化学性质稳定； ③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。 2.载体两性电