生化第十三单元.docVIP

第十三单元? 重组DNA技术 ? 第一节? 重组DNA技术概述 ? 一、重组DNA技术相关的概念 ??? (一)克隆与克隆化? 所谓克隆就是指来自同一母本的所有副本或拷贝的集合；获取同一拷贝的过程称为克隆化，又称无性繁殖。克隆可以是细胞的，也可以是分子的。分子克隆专指DNA克隆。 ??? (二)基因工程? 亦称遗传工程，就是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质——同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA与载体DNA结合成一复制子，继而通过转化或转染等导入宿主细胞(安全宿主菌)，生长、筛选出含有目的基因的转化子细胞。转化子细胞经扩增、提取获得大量目的DNA的无性繁殖系，即DNA克隆，又称基因克隆。“克隆”过程中，将外源DNA(感兴趣的DNA)插入载体分子所形成的复制子是杂合分子——嵌合DNA，所以DNA克隆、或基因克隆又称重组DNA。涉及上述操作过程的各项技术统称重组DNA技术或基因工程。 ??? (三)工具酶? 在基因工程技术中需要一些基本工具酶进行操作。例如，对基因或DNA进行处理时需利用序列特异的限制性核酸内切酶在准确的位置切割DNA，使较大的基因片段或DNA分子成为较小的DNA片段；有时需在DNA连接酶催化下使较小的DNA片段连接成较大的DNA分子。此外，DNA聚合酶、反转录酶、多聚核苷酸激酶和末端转移酶等也是基因工程技术中常用的工具酶。 ??? 限制性核酸内切酶就是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶有三类，基因工程技术中常用的限制性内切酶为II类酶，例如Eco R I、Bam H I等就属于这类酶。大部分II类酶识别DNA位点的核苷酸序列呈回文结构。有的限制性内切酶切割双链DNA后产生5’突出的粘末端，有的限制性内切割DNA后产生3’突出的粘末端或平端。无论何种内切酶、切割后产生何种末端，切割的DNA总是具有5’磷酸基和3’羟基基团。 ? 【执业】1．限制性内切酶是一种 A.核酸特异的内切酶 B. DNA特异的内切酶 C.DNA序列特异的内切酶 D.RNA特异的内切酶 E.RNA序列特异的内切酶 答案：C ? 【执业】2．限制性内切酶的作用是 A.特异切开单链DNA B.特异切开双链DNA C.连接断开的单链DNA D.切开变性的DNA E.切开错配的DNA 答案：B ? (四)基因载体? 又称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。充当克隆载体的DNA分子有质粒、噬菌体和病毒DNA，它们经适当改造后成为具有自我复制、表达功能的克隆载体。 ??? 质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，分子量小的为2～3kb(千碱基)，大的可达数百kb。质粒分子本身含有复制功能的遗传结构，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒携带有某些遗传信息，如对某些抗生素的抗性等，所以质粒在细菌内存在会赋予宿主细胞一些遗传性状。质粒DNA的自我复制功能及特殊遗传信息在基因工程操作如扩增、筛选过程都是极其有用的。 ? 【执业】4.细菌“核质以外的遗传物质”是指(2002) A.mRNA B.核蛋白体 C.质粒 D.异染颗粒 E.性菌毛 答案：C ? (五)聚合酶链反应? 在有模板DNA、特别设计合成的DNA引物及合成DNA所需要的三磷酸脱氧核苷存在时，向DNA合成体系加入热稳定的Taq DNA聚合酶，反应体系经反复变性、退火及扩增循环自动地、往复多次地在两引物间进行特定DNA片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，这就是聚合酶链反应(PCR)。PCR基本工作原理概括如下：反应体系中的一对引物分别与模板DNA两条链的3’端特定序列互补，并恰好使所选择的互补序列分别位于待合成DNA片段的两侧。将反应体系置于特殊装置（自动温度循环器，俗称PCR仪)中，加热至高温（一般为94℃、90s)使模板DNA变性，再退火(55℃、2min)，使引物与模板互补成双链，再升温至72℃，Taq DNA聚合酶催化DNA的聚合反应（通常为3min或视情况而定)。以后再变性、退火，聚合，如此循环改变温度，使聚合反应重复进行。由于每次温度循环所产生的DNA均可作为下次循环合成DNA时的模板，故可使目的DNA片段在两引物间按指数扩增，经历25～30次温度循环后DNA可扩增至一百万倍以上。 ? 【执业】5.现在医学科学工作者通过获得大量特异DNA片段，结合适当的分析技术即可鉴定基因缺陷。当前临床或研究室获得大量特异DNA片段最流行的方法是 A.化学合成 B.DNA合成仪合成 C.从外周血细胞大量制备 D.基因克隆 E.聚合酶链反应 答案：E ?