引物合成材料.pptVIP

引物合成过程 第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5-羟基的保护基团DMT，获得游离的5-羟基； 第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3端被活化，5-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5-羟基发生缩合反应。 　 第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 目前引物的氨解一般都是通过氨水高温处理，将连接在CPG上的引物切下来，在经脱盐纯化得到成品。这种方法在纯化的过程中有可能会造成个别引物无法回收，而我们目前采用的是正丁胺氨解，在纯化时可以避免这个问题，不会经常因无法回收而使引物重合造成发货拖延的情况 最长可以合成多长的引物？ 引物越长，出现问题的概率就越大。目前能合成的最长引物为120base的引物，但是产率很低。除非需