分子诊断技术的应用进展-张健讲述.ppt

sFDA注册主要分子诊断产品（国内企业） 基于扩增基础的分子诊断技术及其应用 1983年Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR），使体外扩增DNA成为可能，开启了体外扩增和操作DNA或RAN技术的发展。在之后的20多年里，扩增DNA的技术成为分子诊断应用最广的技术之一，发展变化了数十种核酸扩增检测技术。目前缺乏统一的核酸扩增技术的分类，但根据DNA被扩增的过程中是变温还是恒温方式，可以将核酸扩增技术分为两类， 温度循环式的扩增技术，以常规（conventional PCR）和实时PCR（real time PCR，RT-PCR）为主， 等温方式的扩增技术，以核酸序列扩增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、转录介导的扩增（Transcription-mediated amplification，TMA），环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等技术为主。 温度循环式的扩增技术 常规PCR：在扩增反应结束后对产物进行电泳或杂交等方式的分析，因此与其他技术的结合衍生出多种分析方法，例如PCR结合限制性长度多态性分析（PCR-RFLP）、PCR结合特异性寡合苷酸探针斑点杂交（PCR-ASO）、PCR结合变性梯度凝胶（PCR-DGGE）、PCR结合的单链构象多态性（PCR-SSCP）等分析技术。 RT-PCR：病原体的多重PCR（Multiplex PCR），提高敏感性和特异性的巢式PCR（nested PCR），研究基因表达的原位PCR（in situ PCR），分析RNA的逆转录PCR（RT-PCR）以及锚定PCR、不对称PCR、膜结合PCR等等。 不同方式的PCR技术 名称 主要用途 简并引物扩增法 扩增未知基因片断 巢式PCR 提高pcr敏感性、特异性，分析突变 多重PCR 同时检测多个突变或病原 反向PCR 扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变 单一特异引物PCR 扩增未知基因组DNA 单侧引物PCR 通过已知序列扩增未知cDNA 原位PCR 研究基因表达 锚定PCR 分析具备不同末端的序列 加热变性 冷却粘合 扩增 连接酶融合 冷却 聚合酶+dNTP 连接酶 点突变的研究、微生物病原体的检测及定向诱变、单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断、微生物种型鉴定，癌基因的点突变研究 连接酶链反应 等温方式的扩增技术 恒温扩增技术主要包括，核酸序列扩增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、转录介导的扩增（Transcription-mediated amplification，TMA）、环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、链置换扩增法（strand displacement amplification，SDA）、滚环扩增法（Rolling Crile Amplification，RCA）、复制酶扩增QB等。 等温方式的扩增技术 NASAB：通过AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、RnaseH三种酶的协同作用为核酸扩增提供动力，逆转录酶将RNA转录成cDNA，生成的RNA-DNA，产物被RnaseH分解为单链DNA，引物2结合DNA，再在逆转录酶作用下合成双链DNA，双链DNA上引物携带的T7RNA聚合酶的启动子序列将DNA转录成RNA，RNA又可以生成DNA，使反应循环发生； TMA：使用逆转录酶和T7RNA聚合酶，在反应中同时利用逆转录酶酶的逆转录活性和Rnase活性，反应动力的维系与NASBA类似： LAMP：技术是利用BstDNA聚合酶的链置换活性提供反应动力； SDA：是应用DNA聚合酶的5‘－3’核酸外切酶活性从双链DNA上的缺口处开始合成新链，剥离旧链，当缺口重复产生时，切割－延伸－链置换的过程循环进行，目的片段被扩增； RCA：利用环状DNA与强链置换活性的?29DNA聚合酶为DNA延伸提供动力 NSAB 操作简便 不需特殊仪器 不需温度循环 循环次数少 忠实性高 特异性好 扩增效率高于标准PCR TMA 以扩增为基础的方法的临床应用 DNA或RNA的扩增技术，最直接的优势是在较短的时间内将目的基因的拷贝数大量扩增，具有很高的灵敏度，同时特异性的引物保证了较高的特异性。因此，在分子诊断技术中基于扩增的技术，特别是荧光定量PCR技术，在实验诊断中应用最为广泛。PCR技术可以准确的定量感染性疾病病原体，不论是真菌、细菌和病毒以及寄生虫的感染都可以应用扩增技术加以检测，同时同一种病原体可以买到多