荧光定量PCR技术原理及应用预案.ppt

荧光定量PCR技术原理及应用 REAL-TIME PCR PCR产物的积累是按照2n指数扩增。PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析。 RT-PCR What is Real-Time PCR? What is Real-Time PCR? What is Real-Time PCR? 所谓实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量和定性分析。 在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，产物不断积累，荧光信号强度也等比增加。通过检测荧光强度的变化，我们就可以得到荧光扩增曲线。 如何对起始模板定量? 通过CT值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。 为什么要用CT值定量？ 在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该CT值具有极好的重复性。 绝对定量 用于生成标准曲线的样品如何设定？ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释 双标准曲线法 （1）不同基因扩增效率存在差异，用标准曲线来校正扩增效率。 （2）比较适合于样本量不大，但研究的基因较多的客户。 （3）双标准曲线：内参基因、目标基因 进行熔解曲线分析，以判断退火温度是否合适，产物中是否有引物二聚体的影响。对于SYBR Green I，一定要在最后做一步熔解曲线的分析，这对于反应条件的优化和结果的正确判定都有着非常重要的作用。 SYBR Green 法 PCR反应的建立 SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测； Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准； MgCl2的浓度：可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物； 反应温度和时间参数：由酶和引物决定； 其他与常规PCR相同。 熔解曲线 PCR中，可控制温度缓慢升高 (ie. 60oc to 95oc, 0.2oc/sec) 双链DNA解链成为单链DNA SYBR Green I被释放，荧光信号消失 以荧光信号强度对温度作图，即为熔解曲线 对熔解曲线求一阶导数，峰值代表Tm Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表序列的特异性。 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 非特异性产物 非特异性产物 Real time PCR流程 样本处理与RNA提取–cDNA–real time PCR 样本处理与RNA提取 外界刺激 –检测目的基因的表达改变 样品处理 –固定、裂解细胞 RNA样本保存液 Trizol 超纯RNA提取试剂盒 RNA的评价与鉴定 - 完整性 - 纯度 小心DNA污染！ - 使用DNaseⅠ - 引物设计 - 以RNA作PCR阴性对照 RT-qPCR一步法还是两步法？ 两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留，检测多个基因，便于反应条件的优化。 推荐：工作的初期阶段，以及单个样本多个靶基因检测。 一步法：简单、灵敏度高，有效减少实验操作误差和污染。每次只能做一个基因。 推荐：工作的成熟阶段，以及多个样本单个靶基因检测。 逆转录 逆转录引物选择 逆转录酶 SuperRT 逆转录酶（RNase H-） M-MLV逆转录酶（RNase H-） 引物 特异性 反应效率 Oligo dT 中 低 Random hexmer 低 中 Specific primer 高 高 引物设计原则 上下游引物间Tm值差小于4 ℃ 避免引物错误引发（特别是3’端与靶基因不配对） 避免引物内和引物间的互补（避免形成发夹结构和引物二聚体） 跨一个或多个内含子设计引物（避免对基因组DNA的扩增） 使用Blast检查引物特异性（/blast) * 高冬妮 常规PCR的局限性： ◆只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量； ◆必需借助电泳方法分析，费时费事而且EB有毒； ◆无法对扩增反应实时检测。 荧光探针杂交技术 PCR技术 荧光定量PCR 荧光 荧光实时定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次