第六章植物原生质体融合技术黄秀梅讲述.ppt

* 植物原生质体融合基本过程 ◆ 盐类融合法 ◆ 高Ca2+和高pH值融合 ◆ 聚乙二醇（PEG）融合法 ◆ PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 ◆ 电融合法 A. 盐类融合法 盐类融合剂种类 硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3) 2 氯化物类：NaCl、CaCl 2 、Mg Cl 2 、 BaCl 2 葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠 盐类融合的优缺点 优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小 缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合 B. 高Ca2+和高pH值融合 Ca2+浓度 0.05 mol/L pH 9.5-10.5 具体做法(以烟草为例) 取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的比例混合; 加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇; 再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液，同时在37℃下保温0.5h; 用0.4mol/L甘露醇洗净高CaCl2和高pH值； 两种原生质体的融合率达到10%。 C. 聚乙二醇（PEG）融合法 Polyethylene glycol(PEG)是一种多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH, 平均相对分子量200-20000之间 融合机制：可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着结合 用相对分子质量为1540的PEG处理40-50 min；再用培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG，得到10%的异核体 D. PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 先用PEG处理30min；（PEG是相邻原生质体表面间的分子桥） 然后用高Ca2+和高pH值液，稀释PEG；（引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布，从而促进了融合） 再用培养液洗去高Ca2+和高pH值 PEG诱导原生质体融合过程 E. 电融合法 原理： 改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。 优点： 对原生质体的损害小，融合率高，重复性强；装置精巧、方便简单，可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。 电融合基本过程 将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极型只有一个小室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3mm，整个装置放在一个培养皿中 微电极型：用5-12微安的脉冲电流间断刺激1-5毫秒，原生质体在几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体,整个过程约10-30分 平行多电极融合装置法：经过1兆赫如150V/cm交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状。在适当时间和强度的直流电脉冲(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，质膜发生被击穿，进一步形成融合体 细胞电融合过程 原生质体的融合过程包括3个主要阶段： 1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合； 3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。 PEG诱导法： PEG规格、纯度，作用时间 电诱导法： 原生质体密度 交流电压 交变电场的振幅频率 交变电场的处理时间 直流高频电压 脉冲宽度 脉冲次数 A、融合体的类型 B、杂种细胞选择的方法 C、细胞杂种的鉴定 A、融合体的类型 自体融合：发生在亲本原生质体自身 异体融合 谐和的细胞杂种：具有双亲全套染色体组的异源两倍体 部分谐和的细胞杂种：双亲的染色体经逐步排斥，便发生少量染色体的重组，然后进入同步分裂，最后形成带有部分重组染色体的植株 异胞质体细胞杂种：亲本的染色体全部被排斥，但胞质是双亲的 嵌合细胞杂种：不同种的双亲原生质体，发生了膜融合和胞质融合，尚未发生核融合。双亲的细胞核各自发生核分裂，接着形成细胞壁，最终形成嵌合体植物 B、杂种细胞选择的方法 互补选择法(遗传或抗性)： 选择一个叶绿体缺失突变体，这一突变体在限定培养基上，能分裂、分化形成植株。具有正常叶绿素的植株，在上述限定培养基上，则不能分裂形成大细胞团（愈伤组织） 可见标记法： 凹穴培养皿分离法：根据融合后异核体和亲本原生质体的形态特征之区别 微吸管分离法：用一种向吸管根据可见标记吸取异核体，进行“看护培养”，以获得杂种植物 生长特性选择法： 利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。 物理特性选择法： 利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度及电脉差异率等差异选择杂种。 其他方法： 如采用显微操作技术也能把单个异核体分离出来进行培养。 异硫氰酸荧光素（FITC）和 异硫氰酸罗丹明（RITC） 分别发