TAIL-PCR原理及应用摘要.ppt

* 　巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。 　巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。 　巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。 TAIL-PCR技术 生物技术2班 组员 徐超平 袁国强 杨立峰 周子琪 任承志 在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA 序列邻近的未知序列。 热不对称交错PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未DNA 序列的分子生物学技术。 在分子生物学研究领域中,利用该技术分离出的DNA 序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针,也可以直接测序。 该技术技术简单易行,反应高效灵敏,产物的特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。 介绍 结构 TAIL PCR原理 TAIL PCR引物设计 TAIL PCR反应程序 TAIL PCR优缺点及其优化 TAIL PCR应用 TAIL PCR以基因组DNA 作为模板，利用依照目标序列旁的已知序列设计的3 个较高退火温度的嵌套特异性引物(special primer, SP)，和一个较短且Tm 值较低的随机简并(arbitrary degenerate, AD)引物组合，通过3 轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR 扩增，获得已知序列的侧翼序列。 原理 目的片段 第1 次PCR 反应 由5 次高特异性反应、1 次低特异性反应、15 次热不对称的大循环构成。通过5 次高特异性的反应,使sp1 与已知的序列退火并延伸,提高目标序列的浓度。1 次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上, 随后进行15 次TAIL 循环。经过上述反应得到了不同浓度的3 种类型的产物:特异性产物和非特异性产物(Ⅰ 型和Ⅱ型) TAIL PCR 一般分为 3次反应： 第2 次反应 将第一级反应的产物稀释1000 倍作为模板,通过15 次热不对称的大循环,使特异性的产物被选择性地扩增,而非特异性的产物被压制到极低的含量。 第3 次反应 又将第2 次反应的产物稀释1000 倍作为模板,通过15 次热不对称的大循环。 通过上述 3次PCR 反应可获得较高含量的与已知序列邻近的目标序列。 Ⅱ、Ⅲ分别为TAIL2PCR 反应中第2 次和第3 次反应的产物 　TAIL PCR 产物分析： 在多数情况下,第1 次反应有较多的非特异性产物特异性引物在第1 次反应中一般不能扩增到可被检测的水平,因此可以省去第1 次反应产物电泳分析，仅仅检测第2 次和第3 次反应的产物来获得特异性的目标片段。取第2 次反应产物和第3 次反应产物成对点样。由于特异引物是嵌套的,因此特异性扩增的特点是第3 次反应产物小于第2 次反应产物。 由于AD 引物在特异性引物的下游有多个退火位点,同一目标序列有时会产生一个以上不同长度的特异性片段。 TAIL-PCR 引物设计 和一般的PCR 反应相比，TAIL-PCR 反应对引物的要求较高，引物的设计很是重要。特异性引物和简并引物的选择直接影响扩增的效果。 特异引物设计 3 个嵌套的特异性引物长度一般在20~