第三章载体说课.ppt

第二篇 基因工程 第三章 载体 基因工程是要按人们的意愿去有目的地改造，创建生物遗传性，因此其最基本的工程就是要得到目的基因或核酸序列的克隆。分离或改建的基因和核酸序列自身不能繁殖，需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。 常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。 1. 载体 （Vectors）：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。 2. 载体的种类（基因工程中常用的载体有5类：） 质粒（plasmid） 、单链DNA噬菌体M13、?噬菌体的衍生物 、柯斯质粒（cosmid）动物病毒（virus） 3.基因工程对载体的要求 （1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记。 （3）有一段多克隆位点。外源DNA插入其中不影响载体的复制。 （4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。 第一节 质粒载体 一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。 1. 质粒的一般生物学特性 （1）分子小：1—200 kb （2）环形状：双链环状DNA。 （3）质粒的空间构型： ① 共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（super coil） ② 开环DNA（ open circular， ocDNA）一条链上有一至数个缺口。 ③ 线形DNA （ linear ，lDNA） （4）质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。 二、质粒的复制类型 1. 严紧型质粒（stringent plasmid）：拷贝数少，只有1—3份拷贝。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。 2. 松弛型质粒（relaxed plasmid）： 拷贝数多，有10—60份拷贝。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。 三、质粒载体的构建 1. 天然质粒的局限性 （1）分子量大，拷贝数低 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。（四环素）Tetr 作为筛选标志，仅有1-2拷贝。 （2）筛选标志不理想 ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。插入外源基因后，失活。可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞，在化学上相当麻烦，在实际操作过程中受到很大的限制。 2. 质粒载体必须具备的基本条件 （1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。 3. 质粒的选择标记及其工作原理： （1）选择标记 ① 抗菌素抗性：绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记： 氨苄青霉素抗性（Ampr）; 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr）; 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr） （2）抗菌素选择原理 不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。 4. 人工构建的质粒载体的类型 1）高拷贝数的质粒载体 ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。 达到每个细胞的拷贝数1000—3000个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。 （2）低拷贝数的质粒载体 由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。pLG338、pLG339、pHSG415等，不适合大量扩增DNA用。 但有特殊用途:当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。 （3）失控的质粒载体 这是一类温度敏感型复制控制质粒。1979年B. E. Uhlin等构建。 如pBEU1、pBEU2。温度低（低于37 ℃ ），拷贝数很少； 温度增加（40 ℃）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。 （4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329。 （5） 表达型质粒载体 主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大