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第五章 细胞冻存与细胞计数 一、非玻璃化冻存冻存方法举例（肿瘤细胞） 1.主要材料 (1)仪器设备：普通冰箱、-20℃低温冰箱和-70～-80℃超低温冰箱、液氮冻存罐、离心机等。 (2)冻存管：容量为1ml或1.5ml。 (3)冷冻保护液：FBS:DMSO:培养基--4：1：5 现配现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴融解。 (4)待冻存细胞：肿瘤细胞 2.冻存过程 (1)待冻存细胞悬液的准备 ①按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物。 ②将细胞悬液以800～1000r／min离心5min，弃上清液。 ③向沉淀物中加入培养基,轻轻吹吸均匀，制备成单细胞悬液，计算细胞总数。 ④将细胞悬液与冻存液按1：1混合，使细胞密度达1×106～1×107个/ml。 ⑤按每管1ml的量，分装于冻存小管内。拧紧管盖。 ⑥在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。 (2)分级冷冻： （有几种方法可以使用） ①先将冻存小管放人普通冰箱冷藏层(4～ 8℃)，约40min。 ②接着置于普通冰箱冷冻层(-10～- 20℃)，30～60min。 ③再于-30℃放置30min左右（可省略）。 ④然后在-70～-80℃下过夜。 ⑤最后将冻存小管投入液氮保存。 还有一种简单的方法，就是将冻存小管先悬挂在液氮罐口20 min，再直接投入液氮中保存。 第三种方法是，用4℃预冷的冷冻保护液悬浮细胞，分装冻存小管后，将冻存小管放在4℃下30min；然后置于壁厚1 cm以上的泡沫塑料小盒内封好，立刻将小盒放置在-70～-80℃冰箱中24h以上至1周；再将冻存小管投入液氮中保存。 (3)记录：做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及冻存经手人。 3.冻存结果 　　如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。 盒夹层内装入100%异丙醇。 程序降温盒放到-80度的冰箱里，盒内温度就会成线性下降，可实现每分钟1℃的降温，可大大的提高细胞的存活率。 程序降温盒 注意事项： 在使用DMSO前，不需要对其进行高压灭菌，因其 本身就有灭菌作用。 在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制冷冻保护 剂时最好带手套。 冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以避免 液氮从液氮罐内溅出。 应注意控制冻存细胞的质量。 勿将冻存的细胞放置在0～-60℃这一温度范围内 过长时间，低温损伤主要发生在这一温度范围内。 二、细胞计数 用细胞计数法测定细胞生长动力学是 目前采用的最普遍的方法。 　　　血细胞计数板人工计数 　　　细胞计数器 血细胞计数板：常用的是改良的纽巴氏 (Neubauer)血细胞计数板。 具体操作程序如下： 1、取血细胞计数板和盖玻片，用75%酒精擦净。将盖玻片放于计数板上。 2、用滴管取混合均匀的细胞悬液，滴入计数室内。要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。滴加细胞悬液后约静置1分钟后则可以进行计数。 3、统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，分别数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数。 对压边线细胞：计上不计下，计左不计右 计算：一般以每毫升含细胞数来表示 大方格的面积为1mm2，室深为0.1mm，则体积为0.1mm3。推算得0.1mm3×104，才为1ml体积。所以计算公式为： 细胞悬液的细胞数/ml 　＝（?四个大格子细胞数/4)?×104?×稀释倍数 计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过高，必须稀 释后再计；如果细胞数太少,可离心浓缩后再计。 每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。 用细胞计数板计数时应注意的事项: ﹙1﹚不要漏计，不要重复 ﹙2﹚细胞悬液应混合均匀 ﹙3﹚浓度不可过高也不可过低。 四、活细胞的染料排除检测法 原理：由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。 最常用的为“台盼蓝排除检测法” (1)0.4％台盼蓝溶液的配制： 称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，40C保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。即成工作液。 (2)活体染色与细胞计数 ①将1滴细胞悬液(贴壁细胞可经0.25％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液)与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。 ②2min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。 注意事项:台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰实验结果。