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第二章微生物常规鉴定技术ppt.ppt
华南农业大学 食品学院 王丽 第二章 微生物常规鉴定技术 食品微生物检验常用的仪器 培养基和实验室基本操作技术 生物安全实验室 生化实验和血清学实验 生化实验和血清学实验 常见的生化反应原理及现象 血清学试验原理 一、概述 (一)、什么是生化试验? 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。 (二) 检验细菌的生化试验范围 1、糖(醇)类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验 3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验 (三)生化试验的方法 在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的PH值变化。 在培养物中加入试剂,观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。 根据酶作用的反应特性,测定酶的存在。 根据细菌对理化条件和药品的敏感性,观察细菌的生长情况。 (四)生化试验的注意事项 1、待检菌应是新鲜培养物。培养18~24h。 2、待检菌应是纯种培养物。 3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间,多为24或48小时。 4、应做必要的对照试验。 5、提高阳性检出率,至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进行试验。 二、糖醇类代谢试验 (一)糖醇类发酵试验 (二)葡萄糖氧化发酵(O/F)试验 (三)V-P试验 (四)甲基红(Methyl Red)试验 MR (一) 糖醇类发酵试验 1.原理:不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同,有的能分解多种糖醇,有的只能分解1~2种糖醇 ,有的分解糖醇能产酸产气,有的分解糖醇只产酸不产气,根据这些特点,可鉴别细菌。 常用的糖醇 单糖:葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖 双糖:乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖 三糖:棉子糖 多糖:菊糖、肝糖、淀粉 醇类:甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇 2、试验方法: 用接种针或环移取纯培养物少许,接种于糖发酵管中,若为半固体培养基,则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃ 培养1~3天,每天观察结果。 3、结果观察和记录 记录: 产酸不产气,阳性,以“+”表示 产酸产气,阳性,以“⊕”表示 不产酸产气,阴性,以“-”表示 (二)葡萄糖氧化发酵(O/F)试验 1、原理: 细菌对葡萄糖的分解,分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖,无氧的条件下不能分解葡萄糖;发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖;不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。 2、方法 取待检菌,以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上,在其中一管加入一层(约1Cm)灭菌的液体石蜡以隔绝空气,在37℃培养2~4h天,每天观察结果。 3、结果观察与记录 (三) V-P试验 1、原理:某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中的氧氧化为双乙酰,在α-萘酚和肌酸的催化作用下,双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物,称V-P(+)反应。 2、试验方法 (1)奥梅拉(O’Meara)法 (2)贝立脱(Barritt)氏法 (3)快速法 奥梅拉法: 将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基,于36±1 ℃培养48h, 每1ml培养液加奥梅拉O’Meara试剂0.1ml,摇动试管1~2min,静置于37℃恒温箱4h ,或在48~50 ℃水浴放置2h后判定结果。 3、结果观察与记录 (1)发酵管出现红色者,为阳性, 记 V-P + (2)发酵管为黄色或铜绿色者,为阴性,记 V-P - (四)甲基红试验(MR) 1、原理 细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后,由于代谢的途径不同,有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物,使培养基PH值下降至pH4.5以下,使甲基红指示剂变红色,为甲基红试验阳性 ;有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物,培养液pH>5.4,甲基红指示剂呈桔黄色,为甲基红试验阴性。 2、试验方法: 挑取新鲜的待试培养物少许,接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基,于36±1 ℃或30 ℃(以30 ℃较好)培养3~5天,从第48h起,每日取培养液1ml,加入甲基红指示剂1~2滴,立即观察结果。 MR-VP试验原理及照片 3、结果观察与记录 (1)呈鲜红色或橘红色为阳性,呈淡红色为弱阳性,记 MR +; (2)呈橘黄色或黄色为阴性,记MR -,迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性,即可判定结果 复习题 1、什么是生化试验? 2、做生化试验要注意哪些事项? 3、简述糖醇类发酵试验的原理,写出其试验方法和结果的记录 5、简述甲基红试验(MR)的原理,写出其试验方法和结果的记录 (一)靛基质
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