第五讲分子生物学研究法上ppt.ppt

分 子 生 物 学 (Molecular Biology) 周 伟 主讲 按照提取试剂的种类来分，可分为：异硫氰酸胍法、盐酸胍法、异硫氰酸胍-苯酚法。 Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂。主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使蛋白质与RNA分子分离，还能保证RNA的完整性。 由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要。 纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.8-2.0之间。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； OD260值=1，相当于单链DNA或RNA为40μg/mL，寡核苷酸为20μg/mL。 PCR反应步骤 DNA解链（变性） 引物与模板DNA相结合（退火） DNA合成（延伸） 重复以上三个步骤 经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n 。 PCR仪 PCR仪 琼脂糖凝胶电泳 最终产物 紫外光观察 2-4 小时 三、DNA测序技术双脱氧链末端终止法 为之序列的测序 已知序列的测序 四、实时定量PCR 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。 实时定量PCR（Real time quantitative PCR ） Theoretical Real Life Log Target DNA Cycle PCR 产物积累规律 PCR扩增中的“平台效应”，导致常规PCR技术对最终产物总量定量的不可靠性。 实时定量PCR的基本原理 在反应体系和反应条件完全一致的情况下，PCR扩增呈指数增长时，模板量与扩增产物的量成正比。由于反应体系中的荧光基团与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。 Real time PCR 常用方法 1、非特异性荧光染料掺入法 常用染料：SYBR Green I 基本原理： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料与DNA双链结合后，发射荧光信号，而自由的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 SYBR l SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ Taq Taq 3’ 5’ 3’ Taq Taq 5’ 5’ SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR l l l l l 优点：① 通用性好，只需要设计PCR引物。 ② 方法简便，省时，价格低廉。 缺点：由于荧光染料和模板的结合是非特异性的，可以检测PCR反应中获得的全部双链DNA，不能有效区分目的双链DNA和非目的DNA分子，所以有时不能真实反映目的基因的扩增情况。 方法的优缺点： 2、特异性荧光探针法 特异性的荧光探针法是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针。通过探针与PCR产物特异性的结合，在PCR过程中可对产物实现均相、实时、定量检测。 TaqMan荧光探针： TaqMan探针是一段与模板DNA部分序列完全互补的寡核苷酸，其5′端标记报告荧光基团（R），3′端标记淬灭荧光基团（Q）； 5’ 3’ R Q Probe 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 。 l 5’ 5’ 3’ 3’ dNTPs Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 加样 变性 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 反应管 Taq l 5’ 3’ R Q Pro