16 DNA重组与基因工程.ppt

第十六章 DNA重组与基因工程 第一节 DNA的重组 第二节 基因工程 第三节 DNA重组技术与医学 第一节 DNA的重组 同源重组 细菌的基因转移与重组 接合作用、转化作用、转导作用 特异位点重组 转座重组 一、同源重组：发生在同源序列间的重组，是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型： 两个同源染色体DNA排列整齐； 一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体； 通过分支移动产生异源双链DNA； Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。 拼接重组体 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 片段重组体 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。 二、细菌的基因转移与重组 1、接合作用：细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细菌转移至另一细菌的现象。 可接合质粒如 F 因子(F factor) 2、转化作用：通过自动获取或人为供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。 例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。 3、转导作用：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。 例： λ噬菌体 溶菌生长途径 溶源生长途径 三、特异位点重组：由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。 1、λ噬菌体DNA的整合 λ噬菌体的整合酶识别 噬菌体和宿主染色体 的特异靶位点发生选 择性整合； 反转录病毒整合酶可特 异地识别、整合反转 录病毒cDNA的长末端 重复序列(LTR)。 四、转座重组：由插入序列或转座子介导的基因移位或重排 1、插入序列(IS) 典型的插入序列组成： 二个分离的反向重复(IR)序列 一个转座酶（transposase)编码基因 特有的正向重复序列 2、复合转座子 转座子组成： 反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因 3、转座方式： 复制型转座(duplicative transposition) 非复制型转座(conservative transposition) 第二节 基因工程 克隆(clone)：来自同一祖先的相同副本或拷贝的集合。 基因克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA连接，继而转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。 基因工程：也叫重组DNA技术，是人类根据需要选择目的基因（DNA片段），在体外与载体重组，再转移到另一细胞或生物体内，以达到改良性状和治疗人类疾病的目的。 一、基因工程相关的酶和载体 1、限制性核酸内切酶：简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 限制性内切酶的分类 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶 限制酶的命名： 限制酶产生的末端： 限制酶识别双链DNA分子中4～8对碱基的特定序列（呈旋转对称型回文结构），大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，产生粘性末端或平头末端。 同裂酶：指来源不同，但识别序列和产生末端相同的核酸内切酶。 同尾酶：指来源不同、识别序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。 2、载体：能够通过基因重组技术携带外源DNA片段到达受体细胞，完成克隆或表达的DNA运载工具。 基本条件： 复制子：与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，使携带的外源DNA一同扩增； 多克隆位点（MCS）：具有多种限制酶的单一识别切割位点，有利于外源基因插入该区域； 筛选标记：抗药基因、酶基因、营养缺陷体及噬菌斑形成能力等，便于筛选出阳性重组体； 较小分子量和较高拷贝数：便于分子操作和质粒扩增； 生物安全性好：要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制。 分类：按来源分为质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，真核细胞载体等。 质粒：细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。 噬菌体：一类非细胞微生物，能高效率、特异性地侵染宿主细胞，然后自主复制繁殖（溶菌途径），或整合入宿主基因组中（溶源途径），在一定的条件下两种状态还会相互转化。 λ噬菌体DNA改造载体 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） M13噬菌体DNA改造载体（含lacZ基因） M13 mp系列 柯