专题1《基因工程》.ppt

同裂酶（Isoschizomers） 有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到的DNA片段经连接后所形成重组序列，仍可能被原来的限制酶所切割。同裂酶之间的性质有所不同（如对离子强度、反应温度以及对甲基化碱基的敏感性等方面可能有所差别）。 　　同尾酶(Isocaudomers) 有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。EcoRI 和MunI属于同尾酶。 1. 载体的必要条件 能自我复制，或能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达； 有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入。 具有某些标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 1、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库. 编码区 非编码区 非编码区 （能编码蛋白质） 启动子 终止子 （2）真核与原核生物基因结构的比较 外显子 内含子 编码蛋白质 （不能编码蛋白质） ①相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区。 ②不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。 真核生物基因结构 外显子：真核细胞基因DNA中的编码序列，这些序列被转录成RNA并进而翻译为蛋白质。 内含子 ：真核细胞基因 DNA中的间插序列，这些序列被转录成RNA，但随即被剪除而不翻译。 从基因文库中寻找 聚合酶链式反应（PCR）扩增 化学合成法 目的基因的核苷酸序列未知 目的基因的核苷酸序列已知 （一）、获取目的基因的常用方法有哪些? 初始目的基因的来源 1. 从生物中直接获取 2. 人工合成 注意：要保持基因的完整性 基因文库 基因组文库 部分基因文库 （如:cDNA文库） 基因文库 如何从基因文库中得到所需要的基因？ 依据：目的基因的有关信息 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。 是否一定要构建基因文库？ 未知目的基因序列时 ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 ③条件：___________、_______________、___________ 、 ___________ . ②原理：__________ 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 模板DNA 四种脱氧核苷酸 DNA引物 热稳定DNA聚合酶 2.利用PCR扩增目的基因 已知目的基因序列时 ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 ④过程 a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ b、复性（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 3.人工合成 ——根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 已知核苷酸序列的较小基因可以化学合成，不需要模板。 质粒 目的基因 限制酶处理 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 表达载体 同一种 1.过程 二、基因表达载体的构建——核心 限制酶切割位点的选择必须保证目的基因，标记基因的完整性，以便于检测和表达。 a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用 思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？ 2、基因表达载体的作用 3.基因表达载体的组成： 它们有什么作用？ a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 位于基因的首端,是mRNA结合位点 位于基因的末端,终止转录 检测目的基因是否导入受体细胞 基因表达载体 1、组成： 目的基因 + 启动子 终止子 标记基因 + + + 复制原点 2、目的基因、启动子、终止子不是质粒上固有的，标记基因、复制原点是质粒上固有的。 3、如果目的基因是从基因组文库中获取的，因为目的基因本身已含有启动子、终止子，在构