第5章_细胞融合与单克隆抗体.ppt

嘌呤合成通路的阻断 有限稀释法 通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的 1）取出阳性孔内的细胞进行计数 2）用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。 3）如果在96孔板内每孔加0.1ml，其机率将为每孔内落入一个细胞。 4）加入一定数量的饲养细胞，经过8~12天后，可观察到有集落生长的孔。 5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。 软琼脂培养法 在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5％的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25％的软琼脂。 待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。 单抗的大规模生产 1）诱生腹水 将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。 方法是将降植烷或石蜡油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接种3~5×106 杂交瘤细胞。10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中约含1~10mg单抗。 2）利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统等进行大规模培养。 3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗 5.2 人源性单克隆抗体制备 5.2.1 EB病毒转化技术 5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术 5.2.3 人单抗制备技术的发展 主要困难 （1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力； （2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的； （3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。 5.2.1 EB病毒转化技术 Steinitz(1977）首先报道利用EB病毒在体外直接感染人外周血淋巴细胞，建立了能分泌半抗原抗体的人B淋巴细胞系。 EB病毒（epstein-barr virus,EBv）是epstein和barr于1964年首次成功地将burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，故名。 1.EBv特征 含双链DNA，基因大小为170kb,含各不相同的重复序列。 EB病毒仅能在B淋巴细胞中增殖，长期潜伏在淋巴细胞内，以环状DNA形式游离在胞浆中，并整合于染色体内。可使其转化，使其获得永生能力。 5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术 人-鼠杂交瘤单克隆抗体 人-人杂交瘤单克隆抗体 EBV转化-融合技术 转基因动物制备单克隆抗体 严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体 杂交人－鼠单克隆抗体 鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系统，还可能引发人对鼠源抗体本身的免疫反应。 在抗体中，Fc片段在抗体中的作用是激活机体免疫反应。 对鼠源抗体进行改造，利用人源的Fc区域的DNA片段替换鼠源单抗的Fc的DNA片段。 嵌合抗体可以保留其目标专一性，降低人的抗鼠反应。 人源单克隆抗体 人单克隆抗体的生产过程和鼠的单抗一样，只是采用认得B细胞和人的瘤细胞。全人单克隆抗体不存在鼠源性异种蛋白的抗原性，不会被人体免疫系统攻击。直接可以用于医疗，很安全。 方法1：分离人B细胞，使之与荧光标记的抗原相结合，通过荧光标记选择能产生特殊抗体的B细胞，并用Epstein－Barr病毒转化，得到少量的单抗。 方法2：将人源免疫干细胞导入缺失大部分免疫细胞的小鼠体内，遇到抗原时，产生人源的抗体。 方法3：将改造过的人的抗体基因导入鼠胚胎中，能在免疫后得到产生人抗体的转基因鼠 转基因动物制备单克隆抗体 人源化的单抗则是制作出鼠的单抗后，利用基因操作手段，置换或者切除单抗基因中鼠源性的蛋白片断，弱化其在人体内的抗原性，达到疗效。（取得抗体效价高的小鼠外周血B细胞，细胞融合杂交后筛出阳性克隆，培养后提取mRNA，反转装入载体测序，基因操作剪切替换，在装入其它载体在合适体系中表达，然后纯化抗体。 ＣＤＲ移植抗体 5.2.3 人单抗制备技术的发展 1.人-鼠嵌合抗体 2.改型抗体 3.组合抗体库技术与噬菌体抗体文库技术 4.表位印模选择技术 1. 单克隆抗体靶向制剂 2. 单抗作为体内体外诊断试剂在临床生化诊断、病理组织定位、肿瘤诊断等方面的应用 3. 肿瘤导向治疗 1、单克隆抗体靶向制剂 1）药物与单抗直接偶联 通过化学反应使药物分子的氨基与抗体分子的羧基之间直接形成稳定的酰胺键。 利用氧化剂把药物分子上的糖基氧化成羰基。 利用羰基与抗体分子的氨基反应形成西佛氏碱，最后还原。 这样的靶向制剂保留一定的药物活性，并具有一定的选择性。 如：1，4－溴柔红霉素与肿瘤细胞单抗形成的偶合物，对肿瘤有明显的选择性毒性。 2）药物通