实验二动物细胞培养液的配制与灭菌重点剖析.pptVIP

本次实验的任务 每组配制1LPBS 生理盐液，并包好瓶口； 每组仔细清洗5-6个培养皿和细胞培养瓶（保证每人一个），分别一起包好； 五、思考题 1、灭菌方式的选择分析 2、 为什么进行细胞培养时培养液中需要加入一定量的小牛血清？ 3、 如何确认你所配制的培养基没有被细菌污染？ * * 关于细胞培养这个概念同学们可以提前预习，我们下次实验来将关于细胞培养的知识。 在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术。 原核生物培养（细菌等原核生物） 真核单细胞生物培养（酵母菌、四膜虫：材料易得，培养方便，繁殖快速。） 植物细胞培养 动物细胞培养 体外细胞培养注意的几个环节： 1、营养：培养基 2、生存环境：无菌环境、合适的温度、一定的渗透压和气体环境 3、废物的排出：定时换培养基 除了满足营养的需要以外，培养环境还必须具备细胞生存并繁殖的生理学接受限度内的物理化学特性。包括：温度、气相及pH等。 适宜的温度与取材的动物种类有关。 哺乳动物包括人类体外培养细胞的理想温度是35－37度，鸟类的体温较高，在38.5度生长较好，35度生长减慢 温度不适宜，影响细胞的代谢及生长，甚至发生死亡。 气体环境，包括氧气和二氧化碳，一般为95％的空气加二氧化碳。二氧化碳为细胞生长所需要，同时又是细胞代谢的产物，并与维持培养基的pH有关。 大多数细胞适于在pH7.2－7.4条件下生长，低于6.8或高于7.6可能对细胞有害，甚至退变或死亡。 无污染环境（无毒、无菌）：无菌培养室（更衣间、缓冲间、操作间）、新洁尔灭擦拭地面、超净工作台 温度适宜；溶解氧、pH和气体环境 各类营养成分：糖（能量）、氨基酸（合成蛋白质的原料）、维生素（细胞内酶的辅酶或辅基）、生长因子（激素类等促进细胞增殖） 渗透压 附着物（贴壁生长）等 * 如果要做一个归纳的化，要使细胞在体外生长，必需满足两大基本条件：一是共给细胞存活所必需的条件，包括营养、温度PH以及气体环境等；另一个就是严格控制无菌无毒条件，防止污染。 * 水是培养用液最主要的溶剂。培养用液中的其他成分只有溶解于水中才有利于细胞吸收摄取。水也是细胞的主要组成成分之一，在细胞内主要起溶剂作用。细胞吸收的营养物质、分泌的产物、代谢的废物都要溶解在水中；细胞内的化学反应、细胞的运动及维持细胞内外的渗透压也离不开水。所以水是离体培养细胞的最基本的生存环境。细胞培养用的各种液体都要用水来配置。 普通自来水含有大量离子及其他杂质，对细胞生长不利，对水的纯度要求很高。三蒸水或超纯水 保存时间短，存放时间不宜超过2周。 通常细胞培养用水的污染物标准可参考医药上注射用水标准，原则上应高于注射用水标准。 主要作用是对细胞间蛋白质水解，使细胞离散。 活性以消化酪蛋白的能力测定，常用1：250，这是酶的活力 消化效果与pH值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关， 对细胞分离作用与细胞的类型与性质关系密切 钙镁离子和血清抑制活性 常用剂量为0.25% （0.1-0.5%），pH值 8（8-9）温度 37。如果你的细胞特别难消化，可以用0.5%，如果浓度再高，就可能对细胞造成伤害了。 主要用于洗涤细胞和组织的 也是合成培养基的基础液。如果含有钙镁离子的话 当用消化液消化细胞时 钙镁离子会破坏消化液的活力 影响消化作用。发现hanks平衡盐溶液有两种：D-hanks和hanks。他们的区别是hanks液中含有MgCl2 、MgSO4 、CaCl2和葡萄糖，而D-hanks中没有。我想请教的是：究竟在什么情况下适合用D-hanks 或者什么情况下适合用hanks？D本来就是去离子的意思。D-hanks不含有CaCl2 、MgSO4.7H2O 和葡萄糖主要用于消化液或其他液时运用。因为消化液中钙离子，镁离子的存在会降低消化液中胰蛋白酶的活力，影响消化的效果。所以消化液不能有钙离子，镁离子！ hanks液主要作为合成培养基（液）的基础液以及用于洗涤组织、细胞等。一般我们需要提取组织中的某种细胞，必须使组织解离分散，然后才能分离细胞，这时就需要用hanks液漂洗组织！ 有两种情况：1、若单独用胰酶消化，则可直接加含有血清的培养基终止消化，因血清蛋白的存在会降低胰酶的活力。而钙离子、镁离子亦会降低胰酶的活力，所以胰酶溶液常用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks’ 平衡盐溶液配制。2、若使用胰酶－EDTA溶液消化（如子宫内膜细胞），这时就要用Hanks 液了，因含血清的培养基不能终止EDTA的作用，而残留的EDTA 会影响细胞生长，所以待细胞变圆倒去消化液后用Hanks 液冲洗干净才行。 你的意思是说Hanks 液有终止EDTA的作用，其机理就是Hanks 液中钙离子、镁离子与EDTA发生络合作用？那么我们用