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特异性和保真度 信号通路的特异性和保真度能够帮助我们衡量系统各组分间相互作用的程度。 1.2 基因调控开关 除了逻辑门遗传线路外，最基本的基因表达调控部件即是控制基因表达的各种“基因开关”。基因开关是指某种化学诱导物存在或缺乏时，或者在两个独立的外源刺激作用下，基因处于两种可能状态中的一种的系统。 1.2.1 转换开关 转换开关(inverter)因其输出是输入的转换函数而得名，即输入为低时输出是高，反之亦然。 天然系统中有许多基因调控的转换开关存在，如正控阻遏系统（即效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态，转录不进行）即可以看做是天然的转换开关：效应分子输入为高时，基因不表达，系统输出为低；效应分子输入为低时，基因表达，系统输出为高 1.2.2 双相开关 噬菌体中通过一个双向操纵子OR来维持溶源状态，这个操纵子由阻遏蛋白CI和反阻遏蛋白Cro（分别由cI基因和cro基因编码）结合到相邻的三个结合位点（ OR 1， OR 2， OR 3)来调控 CI蛋白对cro基因的转录起着负调控作用，对cI基因本身的转录则既有正调控作用又有负调控作用，即我们所说的双相开关(biphasic switch) 双相开关(biphasic switch)机理 1.2.3 Riboswitch 生物体能够通过各种精巧的机制控制基因表达的时间和数量，几年前发现的Riboswitch就是这些精巧机制中的一种。 Riboswitch主要是通过核糖核酸(RNA)构象改变来实现“开关”的功能，阻止或开启目的蛋白的生成 大部分Riboswitch只有一个识别靶向配体的结合位点或适配体( aptamer)；适配体一般位于基因表达区域附近，当其与代谢产物结合时，会改变自身结构，在转录或翻译水平上行使基因调控的功能 Riboswitch可被一种调节sRNA（此处指小片段的调节RNA，非编码RNA的一种，对于真核和原核生物的调节作用非常重要）“打开”，重新激活转录或翻译 Riboswitch在进化上可能是RNA世界遗留的分子化石，广泛存在于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的代谢相关基因中，在真菌和植物中也有发现。Riboswitch调节基因表达不需要任何蛋白因子作为中介，主要参与调节维生素、氨基酸和核苷酸等基础物质的代谢过程，因此可用于研究基因功能、开发新型药物及进行基因治疗 T.S.Bayer和C.D.Smolke等设计的短链RNA基因调控系统 1.2.4 双稳态开关 双稳态开关也称“拨动开关”，可通过人为调控实现基因线路在两种不同稳定状态间的切换 经典的转录水平双稳态开关由两个启动子组成，每个启动子的“开”和“关”状态之间具有明显的界限，只有通过瞬态的诱导因素变化才能切换基因拨动开关至其中的一个稳态，且在移除其输入激励后仍会维持原来的状态。 双稳态开关对于输入信号在一个较宽范围内的变化不敏感，因此对信号扰动具有一定的鲁棒性。通常由一种状态切换到另一种状态时，需要时间来进行转换，因此双稳态开关起始状态为“开”或“关”时会得到不同的响应曲线。这一特性使双稳态开关具有“记忆”的功能，可能会导致细胞状态的不可逆转性。 J．J．Collins课题组构建的经典的双稳态开关 基因线路设计 图中有两种不同的启动子——启动子1和启动子2，它们分别控制着阻遏子2和阻遏子1基因序列的表达状态；而阻遏子2和阻遏子1基因表达的产物又会分别抑制启动子2和启动子1的启动。阻遏子1下游报告基因的表达产物可以作为输出信号表征系统目前所处的状态。由于上下游基因的启动和相互抑制，整个系统共有下面两种稳定的输出状态。 系统的两个外部输入信号——诱导物1和诱导物2，分别能解除阻遏子1基因的表达产物对启动子1的抑制作用和阻遏子2基因的表达产物对启动子2的抑制作用。他们的加入可以实现系统在两种状态之间的转换，是人工实现状态切换的手段 当系统稳定于状态A时，通过加入诱导物2，可以解除阻遏子2对启动子2的抑制作用，使得阻遏子1表达，从而抑制启动子1，终止阻遏子2的表达。一段时间后，系统从状态A转换至状态B，而即使解除诱导物2的输入，系统依然会稳定与状态B 同理，加入诱导物1作用一段时间，也可使系统从状态B切换到状态A。 如果将诱导物1和2的加入看作是对开关的“拨动”，那么每次拨动后，系统都会稳定于相应的状态，而不需要其他外界信号来维持 基因线路实现 基因线路实现 研究者利用不同的载体，分别构建了两类不同的双稳态开关。 一类是利用方案A和方案B在pTAK载体上构建双稳态开关，称为pTAK类 一类是利用方案A和方案C在pIKE载体上构建双稳态开关，称为pIKE类。 IPTG 温度 IPTG aTc 功能的检测 所有的双稳态开关都被转入大肠杆菌JM2. 300菌种中验证其功能。带有双稳态开关质粒的大肠杆菌在培养基