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RFLP原理及在作物基因定位和育种中的应用 生物技术123 丁延青 RFLP的原理及其特点 个体差异差异大多数都是由于不编码蛋白质的区域和没有重要调节功能的区域发生中立突变。这些突变构成的差异成为DNA多态性。 假如DNA 顺序中的某个碱基发生了突变，使突变所在部位的DNA 序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。这样，利用该限制性内切酶消化此DNA 时，便会产生与正常不同的限制性片段。在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP ）。 RFLP作为一种“遗传路标”，对人类基因组制图提供必要的标记，当多态性顺序与人类遗传性疾病位点连锁时，可作为遗传缺陷的产前诊断或是鉴别携带者的标记，还可以应用于亲子鉴定和群体研究等方面。 技术路线 01 DNA的提取 实验首先是提取高质量的基因组DNA，与其他分子标记实验相比，RFLP对DNA的质量要求最高,而且要保证一定的数量。 DNA的抽提方法大多采用CTBA法。以玉米为例其方法是：取新鲜叶片加液氮快速研磨成粉末,加1.67×CTAB溶液(83.5mM tris-HCl,1.17mM NaCl,16. 7mM EDTA,1.67% CTAB)和β-巯基乙醇,于65℃水浴中保温1h ,加入氯仿: 异戊醇( 24: 1)摇动30min,然后加适量异丙醇沉淀DNA，勾出DNA,吹干后加入T E溶解。最后用苯酚: 氯仿( 1: 1)和氯仿: 异戊醇( 24: 1)纯化,容于T E,加RNA酶A,于37℃保温0.5h,保存在4℃冰箱中。 放射自显影 05 标记探针,每泳道探针DNA用量为5ng。分子杂交,探针与尼龙膜保温在65℃ ,缓慢转动16～18h。洗膜压片,取出杂交膜,用SSC、SDS洗去末杂交上的探针, 直到杂交膜上的放射性到100～200counts /min为止。用保鲜膜将尼龙膜包好,压上X光片,在- 70℃下放射自显影5～ 15d。洗片、显影结束后取出,定影、凉干保存。 主要影响因素 RFLP实验步骤繁琐个步骤应小心操作 （1）：制备高质量的DNA，这是实验的基础 （2）：在电泳时，每个泳道加载的DNA的量也是一个至关重要的因素。 （3）：标记探针时,所加的同位素的量应为2. 5μCI /μgDN A,过多过少均不能取得预期的结果。 3 作物基因研究和育种中的应用 1：RFLP用于基因定位的研究 RFLP连锁图可以用于数量性状或质量性状基因定位研究。 （1）质量性状基因定位主要有两种，一种是近等基因系（NILs），一种是群分法（BSA）。 NILs基因定位原理 利用NILs进行基因定位的原理,就是寻找能在NILs间表现多态性的分子标记, 从而推测目的基因将位于该分子标记附近。由于NILs的基因构成特点,可以预计,凡是能在NILs间显示多态性的分子标记应有较大的可能位于目的基因的两边近侧。要证实这种推测,须在目的基因的分离群体中进行标记与基因的共分离测验,并通过这种连锁分析,计算两者之间的遗传距离。 NILs基因定位的应用 利用NILs, N. D. Young 等用RFLP标记定位了番茄的TM-2a[21]基因; 梁承志也用RFLP定位了水稻半矮秆基因Sdg[14] ,证明了这种方法的可行性和有效性。 群分法（BSA)基因定位原理 原理为迅速寻找与目的基因紧密连锁的分子标记,可用目的性状的表现型或基因型作为依据,将分离群体中的植株分成两组进行比较。在每一组中选取一定数量的植株, 将每株DN A在组内等量混合,形成每个DN A混合池,这样成对的DNA池彼此之间仅在目的基因附近的区域存在差异,而其它区域相同,类似于N ILs,称之为近等基因池。 利用BS A法国内外科学家已定位了水稻、莴苣、蕃茄等作物的基因  RFLP用于数量性状基因(QTL)的定位研究 其主要步骤为 （1)分子标记的检测、筛选及其连锁图的构建。 （2）选择和培育含有目的性状的最佳基因型或组合,要求目的性状容易观察和识别,双亲遗传差异较大。 （3）采用适当的试验设计,减少外界环境对数量性状表现的干扰。 采用随机区组设计、重复、小区技术等环境设计的基本原理,尽量控制环境误差,通过适当的方式将供试基因繁殖,从而采用基因型均值而不是个体值进行分析,以部分抵消环境的影响。 2 RFLP用于作物育种研究 一副高度饱和的RFLP连锁图,为基因选择、回交育种、预测杂种优势以及基因克隆等方面提供了诸多方便。利用与目标基因连锁的RFLP