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第二章 微生物学经典技术 课程标准 本章要点 第一节 显微技术 第二节 无菌技术 第三节 分离技术 第四节 培养技术 几种常用菌种保藏方法的比较 要从含有成亿个细胞，成百个种类微生物的样品中分离出某种微生物，并不是容易的事。 第一个成功地分离出纯种细菌的，是前面提到过的在手术中采用消毒剂的医生李斯特。关键在于他发明了一种可以取出数量可以小到0.00062毫升牛奶的微量注射器。 李斯特用不含任何微生物的灭过菌的水稀释极少量的牛奶，再把稀释的牛奶分装在几个灭过菌的酒杯中，成功地分离出制造酸奶用的乳酸链球菌（Streptococcus lactis ）。这种方法经过100多年的改进，现在仍然是一种分离纯种微生物的常用方法，叫做系列稀释法，也叫倍减稀释法（Ten-Fold Diluted Method ）。 十倍递减稀释法（Ten-Fold Diluted Method ) 真正解决问题的纯种分离方法，是著名的德国医生，伟大的微生物学奠基人之一科赫和他的研究小组建立起来的。 科赫在明胶中加上一些营养物质（例如肉质）加热融化后倒在一片灭过菌的玻璃片上，待其凝固 用在火焰上烧红过、因而烧死了全部原来附着的微生物的白金丝蘸上一点要分离的样品 在凝固的明胶上轻轻划动，使样品中的很少量微生物沾在明胶上，然后用玻璃罩盖上玻璃片，以防空气中的杂菌落下污染。 几天后，明胶板上便长出一个个彼此分开的菌落 由于明胶是透明的，所以很容易观察 因为白金丝烧红后很快便会冷却，立即用来蘸样品时也不会烧死样品中我们需要分离的微生物。现在我们用电炉丝代替，价格便宜多了，这就是我们今天常见的接种针和接种环 这种方法叫划线分离法 平板划线分离法（Streak Plate Method） 另一位助手Petri又设计了一种圆形的有边的，可以对着盖起来的培养器具，使得融化的洋菜或明胶不会随便乱流，又可以避免污染杂菌，这就是每个微生物学工作者都非常熟悉的培养皿（Petri Plate）。 但是，明胶在摄氏20多度会融化，在一般细菌生长需要的37℃下不能成为固体，菌落便不可能形成。 科赫的助手Heese在他妻子的提示下，发现用洋菜（学名叫琼脂agar，一种做果酱的植物胶）代替明胶，可以克服明胶在37℃会融化的缺点 柯赫（Robert Koch） 的助手W Heese和 他的夫人Fran Heese 为了排除这个疑点，当时人们采用反复多次，并仔细用显微镜检查的办法。后来，有人发明了可以在显微镜下用极细的玻璃丝挑取单个细胞的工具——单细胞分离器，纯种分离的技术便成熟了。 我们也许会提出一个疑点：在马铃薯片或琼脂上长出的菌落真是由一个微生物细胞繁殖来的吗？ 可能不是! 长期实践的经验告诉我们，尽管不用单细胞分离器有一定风险，但是用稀释法或划线分离法，在适当重复操作后，在很大程度上可以达到纯种分离的目的。 为了获得单一类型微生物，即纯培养物Pure culture，微生物学家通常采用称作富集培养的技术。所谓富集，就是指在分离纯培养之前，通过这种技术使需要分离的对象在培养基中尽量生长得多一点。为了富集，首先要选择好适合对象微生物的培养基，微生物学家称为选择性培养基(Selective medium)。 根据这个原理，我们如果想得到具有某种特定功能的微生物，首先可以用选择培养基来进行富集。如果我们想得到能够分解橡胶或塑料的微生物，就可以在培养基中加进橡胶或塑料。虽然我们在自然界中可以见到一些对简单的富集技术无动于衷的微生物，但一般说来，富集培养是寻求微生物纯培养的第一步。 一个简单的例子是引起伤寒的伤寒杆菌，当刚从伤寒病患者体内分离出来时，常常需要向培养基中补加一种氨基酸促进它们生长，但在实验室中培养几次后，它们容易丧失此种特性，即变得能够自己制造这种氨基酸了，当用该菌株去感染实验动物并再度分离它时，它又恢复了需要氨基酸的这一特性。 我们在实验室中分离纯化的微生物是否与自然界实际存在的完全一致呢？ 这是个问题?! 已故的荷兰卓越微生物学家克鲁维教授早就指出，所有的细菌培养物均是实验室的人工产物，为了适应实验室的生长条件，这些微生物的特性已经起了变化。 我们必须牢记，不要把实验室中微生物材料的表现完全等同它们在自然环境中的情况。 2 纯种分离的主要方法 用固体培养基分离纯培养 用液体培养基分离纯培养 单细胞（孢子）分离法 选择培养分离法 用固体培养基分离纯培养 1、稀释倒平板法(Pour Plate Method 2、涂布平板法(Spread Plate Method) 操作较麻烦，对 好氧菌、热敏感 菌效果不好！ 使用较多的常规 方法，但有时涂 布不均匀！ 用固体培养基分离纯培养 3、平板划线法 用固体培养基分离纯培养 3、平板划线法 2 扫描电子显微镜(Scan Elec