第四章工业微生物育种诱变剂资料.pptVIP

* * 第四章 工业微生物育种 诱变剂 第一节、物理诱变剂 包括紫外线、X射线、r射线、快中子、微波、超声波、电磁波、激光射线和宇宙线等。其中对微生物诱变效果较好,应用较广泛的是紫外线、X射线、r射线和快中子。 物理辐射可分为电离辐射和非电离辐射。 一、物理诱变剂的生物学效应 1、 物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。 2、辐射引起的生物效应，根据辐射种类和微生物种类不同有所差异。 3、同一种辐射线对不同微生物的效应不一样，这与每种微生物修复系统的强弱有关。 二、辐射引起生物效应的影响因素 1．微生物的遗传背景 ：G+C% 2．微生物的生理状态 3．可见光 4．细胞水分 5．温度 尤其对于电离辐射，较高温度能促进氧与自由基之间的相互作用、加速与DNA发生的化学反应。在氧气充足的条件下要比在缺氧条件下的电离辐射的生物学效应显著。 三、非电离辐射——紫外线 （一）紫外线的诱变机制和DNA损伤修复 1．紫外线的诱变机制 有的是DNA与蛋白质的交联．有的是胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用，有的是DNA链的断裂，还有的是形成嘧啶二聚体。形成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因。 2．DNA损伤修复 光复活 切除修复 （二）紫外线诱变 1．紫外线有效光谱 最有效的波长为253.7nm，而15w紫外灯管放射出来的紫外线大约有80％波长集中在253.7nm。 2．紫外线的辐射剂量 分绝对剂量erg-1/mm2和相对剂量照射时间或者杀菌率表示 。 一般认为杀菌率以90％-99.9％效果较好。但也有报道，认为较低的杀菌率70—80%有利于正突变菌株的产生。 （三）紫外线诱变的步骤与方法： （1）出发菌株 细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子刚成熟。 （2）前培养 对细菌类以肉汤为主，适量加人核酸类物质或酵母膏等制成营养丰富的培养基，还可加人抑制修复的物质，如咖啡碱或异烟肼等。 （3）制备菌悬液 单细胞：细菌约108 ml-1；放线菌约107～108ml-1，霉菌约106 ml-1。 （4）紫外线照射 3-5ml，搅拌；避光，提前20min预热紫外灯。结束时冰浴1-2h。 （5）后培养 冰浴后的菌悬液加人到适合于正突变体增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.5～2h。有些在增殖培养基中加人适量的酪素水解物、色氨酸或异烟肼等物质，可以抑制修复，有利于突变体繁殖和减少细胞悬液在贮存过程中的死亡。 3．电离辐射的照射方法 菌悬液较好，不宜过多。照射后冰浴2-3h低温可降低或抑制修复酶的活性。 四、电离辐射 1．常用于诱发突变： 快中子、X射线线和r射线等。 2．电离辐射剂量 拉德（rad）也可以转成伦琴（R）； 不同种类菌种最适的剂量范围不同；对不同的射线的敏感度也不同；不宜反复照射。杀菌率90％-99.9％为宜 。 五、近年的新型诱变剂 1．微波 2．红外射线 3．激光 4．高能电子流 5．离子注入 第二节 化学诱变剂 化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。 化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，不能直接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防上污染环境，造成公害。 化学诱变剂是一类能对DNA起作用、改变其结构、并能引起遗传变异的化学物质。 一、碱基类似物 用于诱发突变的碱基类似物有5-BU、5-FU、BUdr、5－IU等他们是胸腺嘧啶的结构类似物，AP、6-MP是腺嘌呤的结构类似物。最常用是5－BU和AP。 当将这类物质加人到培养基中，在繁殖过程中可以掺人到细菌DNA分子中，不影响DNA的复制。它们的诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，因此，也叫掺人诱变剂。显然这一类诱变剂要求微生物细胞必需处在代谢的旺盛期，才能获得最佳的诱变效果。 （一）碱基类似物的诱变机制 正常的碱基存在着同分异构体，互变异构现象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出现，而嘌呤分子中以氨基和亚氨基互为变构的形式出现、一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA碱基中频率更高。 5-BU导致AT碱基对转换为GC碱基 2-氨基嘌呤也可以诱发DNA分子中AT－GC或GC－AT的转换。 （二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例） 1．单独处理 将微生物液体培养到对数期，离心除去培养液，加入生理盐水或缓冲液，饥饿培养8-10h，消耗其体内的贮存物质，将5-BU加入到经饥饿培养的培养液中，处理浓度为25-40ug／ml，混合均匀．取0.1-