腺病毒介导hSulf1表达对肿瘤细胞周期和化疗敏感性影响的实验研究.pdfVIP

腺病毒介导hSulf-1表达对肿瘤细胞周期及化疗敏感性影响的实验研究 中文摘要 腺病毒介导hSulf-1表达对肿瘤细胞周期 及化疗敏感性影响的实验研究 中文摘要 人硫酸酯酶 1 （human sulfatase 1,hSulf-1）基因定位于人8号染色体长臂 8q13.39，编码一种芳香硫酸酯酶，在某些肿瘤细胞系可明显抑制肿瘤生长迁移 及增强一些抗癌药物诱导的凋亡作用，因此被认为是肿瘤抑制因子。硫酸乙酰肝 素蛋白多糖 （HSPGs）是细胞外基质的重要组成部分，能够直接介导肝素结合的 细胞生长因子配体和特异受体（HB-GFR）之间的相互作用。hSulf-1能够使HSPGs 脱硫酸化，抑制HSPGs介导的信号通路的活性，进而抑制细胞的增殖、侵袭、 迁移、血管增生及转移灶的形成。除此之外，它还与细胞的粘附性、细胞骨架修 复、凝血功能、以及转化生长因子β （TGF-β1）、Wnt/β-catenin、AKT/ERK和细 胞上皮间质转化的信号通路的活性高度相关。本研究旨在构建含有目的基因 hSulf-1 的多种类型腺病毒表达载体（包括非增殖型腺病毒Ad5-hSulf1、溶瘤腺 病毒AdSurp-hSulf1和放射诱导增强型溶瘤腺病毒Ad.eSurp-hSulf1）， 究hSulf-1 对肝癌细胞周期以及对乳腺癌化疗敏感性的影响，探讨hSulf-1抗肿瘤效应及其 分子机制。我们的研究为将来进行肿瘤靶向治疗奠定了基础。 第一部分 腺病毒载体构建及鉴定 【目的】克隆 hSulf-1 基因并构建稳定表达的非增殖型腺病毒载体 Ad5-hSulf1、肿瘤特异增殖型溶瘤腺病毒载体AdSurp-hSulf1、放射诱导增强型溶 Ad.eSurp-hSulf1 EGFP 瘤腺病毒载体 及其相应的携带绿色荧光报告基因 （ ）的阴 Ad5-EGFP AdSurp-EGFP Ad.eSurp-EGFP 性对照病毒 、 、 。 pcDNA3.1-hSulf1 BamHI SalI 【方法】以质粒 为模板，设计含有 和 酶切位 点的hSulf-1基因上下游引物，采用PCR 的方法扩增出含有hSulf-1基因的完整 pDC315 hSulf-1 pDC315-hSulf1 序列，将 及 基因酶切回收的产物连接，得到 ；以 hSulf-1 pAdSurp-P53 P53 pAdSurp-hSulf1 基因酶切回收产物置换 中的 序列，获得 ； I 中文摘要 腺病毒介导hSulf-1表达对肿瘤细胞周期及化疗敏感性影响的实验研究 在pAdSurp-hSulf1启动子Surp上游插入Egr-l基因CArG调控元件作为增强子构 建 pAd.eSurp-hSulf1。以EGFP 基因置换 pDC315-hSulf1、pAdSurp-hSulf1、 pAd.eSurp-hSulf1 中的 hSulf1 ，构建 pDC315-EGFP 、pAdSurp-EGFP 、 pAd.eSurp-EGFP 。鉴定正确后， 用 Lipofectamine2000 转染试剂，将 pDC315-hSulf1、pAdSurp-hSulf1、pAd.eSurp-hSulf1 分别与腺病毒包装质粒 pBHGloxdelEl3cr