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N 糖基化修饰对B7-H3 生物学功能影响的初步研究 中文摘要 中文摘要 目的 蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，它参与并调控了许多关键的生命活 动，且与许多疾病的发生有关，因此越来越受到广泛的重视。 B7-H3 是共刺激分子家族中一个新成员，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白。2IgB7-H3 是B7-H3 在人体内剪接体之一，其氨基酸序列上有4 个N-糖基化修饰位点和1 个 O-糖基化修饰位点，ProtParam 软件预测计算其分子量为 33.7Kd,而实际分子量为 55Kd，推测糖基化约占其分子量的38%，如此高度的糖基化修饰可能与B7-H3 的 功能有关。 B7-H3 在很多肿瘤细胞中都有高表达，在不同肿瘤细胞中功能不尽相同，可 能是一个肿瘤抗性的调控因子。B7-H3 在胃癌细胞中有较高的阳性表达率，其表 达与患者生存期、肿瘤浸润程度、组织类型相关。胃癌细胞中 B7-H3 能够促进 β3GnT8 和多聚乳糖胺糖链表达，生物信息学模拟B7-H3 和β3GnT8 蛋白三维结构 中，发现二者能够空间对接。 本文基于已构建好的 2IgB7-H3 重组载体，利用快速定点突变方法构建去 N- 糖基化2IgB7-H3-mut 真核表达载体，并将其稳定表达于人胃癌细胞SGC-7901 中， 初步观察B7-H3 糖基化与否对细胞生物学功能的影响。 方法 1.利用快速定点突变的方法，构建 2IgB7-H3 去 N- 糖基化突变表达载体 pIRES2-EGFP/2IgB7-H3-mut 。 2.利用脂质体将空表达载体、正常及去N-糖基化的2IgB7-H3 表达载体转染至 人胃癌细胞SGC-7901 中，经G418 筛选获得2IgB7-H3 去N-糖基化前、后的稳定 表达细胞株SGC-7901/2IgB7-H3 、SGC-7901/2IgB7-H3-mut 以及空载体稳定表达细 胞株SGC-7901/mock 。 3.利用流式细胞术检测SGC-7901/2IgB7-H3-mut 相对于 SGC-7901/2IgB7-H3、 SGC-7901/mock 细胞周期的差异；利用MTT 法检测SGC-7901/2IgB7-H3-mut 相对 I 中文摘要 N 糖基化修饰对B7-H3 生物学功能影响的初步研究 于 SGC-7901/2IgB7-H3 、SGC-7901/mock 细胞增殖能力的差异；利用划痕修复实 验检测 SGC-7901/2IgB7-H3-mut 相对于 SGC-7901/2IgB7-H3 、SGC-7901/mock 对 细胞水平迁移能力的影响。 4.RT-PCR 、 Western Blot 检 测 SGC-7901/2IgB7-H3-mut 相 对 于 SGC-7901/2IgB7-H3 、SGC-7901/mock β3GnT8 表达的差异。 5. 流式细胞术检测 SGC-7901/2IgB7-H3-mut 相对于 SGC-7901/2IgB7-H3 、 SGC-7901/mock 对多聚乳糖胺糖链表达的影响。 结果 1.限制性内切酶和DNA 测序鉴定表明，成功构建人2IgB7-H3 去N-糖基化真 核表达载体pIRES2-EGFP/2IgB7-H3-mut 。 2.经G418 筛选、RT-PCR 和Western Blot 鉴定，成功获得稳定表达2IgB7-H3-mut 的细胞株SGC-7901/2IgB7-H3-mut 。 3.与 SGC-7901/mock 相比：SGC-7901/2IgB7-H3-mut 和 SGC-7901/2IgB7-H3 2IgB7-H3 mRNA 表达量均明显升高(P ＜0.001) ，且 SGC-7901/2IgB7-H3-mut 与 SGC-7901/2IgB7-H3 相比差别无统计学意义(P ＞0.05) ；与SGC-7901/mock 相比： SGC