辅助调整过敏体质.docVIP

健康食品之輔助調整過敏體質功能評估方法 960712衛署食字第0960403113號公告 壹、前言 健康食品的「輔助調整過敏體質」功能評估，是減少過敏免疫反應之功能評估。所謂降低過敏免疫反應，針對不同過敏型式有各種過敏反應的指標，例如：降低血清過敏抗體含量、降低發炎反應、減少過敏反應相關細胞激素或介質的分泌、調節T細胞分泌細胞激素、降低呼吸阻力等。但必須在不影響正常免疫反應的情況下，對過敏指標有減輕作用，對健康才有助益。若以動物實驗可以過敏原致敏動物，再進行抗原特異性免疫反應的評估。至於人體的改善過敏的評估，可由正常人與過敏傾向的人分別進行。 貳、實驗方法 一、動物實驗 實驗動物：建議選用小鼠，常用的Balb/c或是B6小鼠皆可，6-8週大，雄鼠或雌鼠皆可，每組隻數為單一性別至少10隻。 （一）致敏小鼠 本動物實驗之過敏免疫反應是以腹腔注射過敏原的模式進行，採用過敏原作為抗原，可以氫氧化鋁作為佐劑(adjuvant)，在注射抗原前及注射抗原一週後以眼窩採血，取得血清進行抗原特異性抗體濃度之分析，確立動物過敏模式之建立，必要時須致敏三至四次。對於呼吸道過敏之動物模式，宜另以噴霧致敏法使從呼吸道接觸過敏原，鼻腔過敏之動物模式宜以鼻腔接觸過敏原等各種不同過敏動物模式。 1. 血液抗體濃度 (1) 可利用sandwich-ELISA免疫呈色反應法或Radial immunodiffusion (RID)法，定量血清中免疫球蛋白IgE、IgG、IgM、IgA和總抗體含量 利用免疫呈色反應法測定免疫球蛋白濃度：將血清加入表面已覆蓋免疫球蛋白抗體的96孔盤中，靜置反應後，再加入標有呈色酵素的抗體作用，最後加入呈色劑並與標準值對照，經由可見光吸光測定分析計算便可以算出免疫球蛋白濃度。 RID方法為：將血清放入培養孔中，靜置24至48小時後，再測量其直徑大小，與標準值對照，算出免疫球蛋白濃度。 過敏原誘發的特異性抗體產生 利用免疫呈色反應法測定抗原特異性免疫球蛋白濃度：將血清加入表面已覆蓋過敏抗原的96孔盤中，靜置反應後，再加入標有呈色酵素的抗老鼠IgE、IgG1或等抗體作用，最後加入呈色劑並與標準值對照，經由可見光吸光測定分析計算便可以算出免疫球蛋白濃度。 2. 脾臟或是淋巴結細胞增生反應 細胞增生能力即指免疫細胞受到刺激時，能夠增生的能力。故增生能力之表示，以添加裂殖素後，細胞增生的數值為未添加裂殖素時數值的倍數，稱為增生指數(Stimulation Index)，簡稱S. I.。 本實驗的細胞增生的刺激物須包括過敏原和裂殖素，T細胞須以過敏原刺激培養，另可使用如ConA、PHA等裂殖素或抗CD3抗體的刺激劑，以分析T細胞的增生反應。B細胞須以過敏原刺激培養，另可使用如LPS來刺激，分析B細胞的增生反應。 進行步驟： (1) 3H-thymidine嵌入法 本方法較靈敏，將脾臟細胞2x 106/ml置於96孔盤，再加入RPMI培養基或分別添加有LPS、Con A、PHA等細胞裂殖素的培養基。於37℃二氧化碳無菌培養箱培養兩天後，加入1μCi/well 3H-thymidine，繼續培養 20小時後，以細胞收集儀收集細胞於濾紙上，濾紙風乾後以閃爍計數儀測3H-thymidine含量，計算細胞增生能力。 (2) MTT法 MTT的測定方法，是利用細胞本身的酵素對受質的作用，產生顏色的變化，再進一步測定其吸光值。如果細胞受到細胞裂殖素的刺激，增生越多，則活的細胞愈多，酵素的活性就會較高，可以測到較高的吸光值。利用此一原理，也可以來測定細胞的增殖反應，但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度較高，對懸浮性細胞則較不理想，細胞數與吸光值的直線相關有飽和現象，吸光值無法代表細胞數值，以致較不靈敏，進行本實驗時應特別注意。 (3) 螢光流體計數儀來測定DNA的染色 利用螢光染色的方法來分析細胞是否受到刺激，細胞核內的DNA是否有任何變化，可以利用bromodeoxyuridine (BrdU) 的方法來染色。BrdU的方法則需要再加上一個抗BrdU的單株抗體加上螢光，才能利用螢光流體計數儀來加以分析。為了進一步分析是那些細胞的DNA有增加的變化，可以同時對這些細胞進行表面標記的分析。如利用抗CD3及抗B220抗體先行染色，再將細胞加以固定，然後進行DNA的染色。對細胞的表面標記及細胞內的DNA螢光使用不同波長的螢光，以便能夠在儀器上能對這兩群不同的細胞進行分析。如果能夠達到此一目的，便能夠不需要將細胞分離出就可以知道是那些細胞受到活化。 3. 細胞激素分泌實驗 將分離出的淋巴球以5x106/ml的濃度置於24-孔盤中，利用已經定量過的過敏原、Con A或抗CD3抗體來刺激這些淋巴球。經過24到48小時的培養後，將上層液離心