酶工程1-5-7酶活力测定--精讲.pptVIP

第五节 酶的活力测定 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。 酶活力的大小可以用一定条件下所催化的某一化学反应的反应速度（reaction velocity）来表示，两者呈线性关系。 酶反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。 （一）酶活力测定方法 测定要求：快速、简便、准确 测定方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法等 测定阶段：（两阶段）反应一段时间 和 测定S或P变化量 测定步骤： 1）选择配制适宜底物溶液； 2）确定反应温度、pH值、底物浓度（＞5Km）、激活剂浓度等条件； 3）酶液和底物混合，反应开始并记录起始时间； 4）反应到一定时间，终止反应（使酶失活或变性），取出适量反应液，测定其中产物或底物的改变量。 （二）酶活力单位 酶活力的大小及酶含量的多少，用酶活力单位数表示，即酶单位（U）。 酶单位的定义是：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。这样酶的含量就可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示（U/g或U/ml）。 1961年国际生物化学和分子生物学联合会规定用“国际单位（IU）”表示酶活力： 在特定条件（25oC,在最适底物浓度、最适缓冲液离子强度和pH值等）下，每1min 催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个国际单位（IU）。1 IU=1 μmol/min 1972年又推荐一种新的酶活力单位——katal（Kat）。一个katal单位是指在最适反应条件下，每1s 催化1moL底物转化为产物所需要的酶量。 1Kat= 1 mol/s 1Kat=6?107 IU，1IU=16.7 nKat （三）酶的转换数和催化周期 酶的转换数KP，指每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的摩尔数，又称摩尔催化活性（mol catalytic activity）。即每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数，是没催化效率的一个指标。 KP通常用每摩尔酶的酶活力单位数表示，单位min-1。 酶的催化周期 T：即酶的转化数的倒数，指酶进行一次催化所需要的时间，单位毫秒（ms）或微秒（μs）。T=1/ KP 酶的KP常在103左右。碳酸酐酶的KP最高，达3.6×107min-1；其催化周期为1.7 μs。 （四）固定化酶的活力测定 定义:与水不溶性载体结合、在一定范围内起催化作用的酶。 测定方法： 1）震荡测定法； 2）酶柱测定法； 3）连续测定法； 4）固定化酶的比活力测定； 5）酶结合效率与酶活力回收率测定； 6）相对酶活力的测定。 1）震荡测定法 称取一定重量的固定化酶, 放进一定形状一定大小的容器中, 加入一定量的底物溶液, 在特定的条件下, 一边振荡或搅拌, 一边进行催化反应。经过一定时间, 取出一定量的反应液测定酶活力。 固定化酶反应液的测定方法与游离酶反应液的测定方法完全相同。 在固定化酶反应时, 振荡或搅拌方式和速度对酶反应速度有很大影响。 在振荡或搅拌速度不高时, 反应速度随振荡或搅拌速度的增加而升高, 在达到一定速度后, 反应速度不再升高。若振荡或搅拌速度过高, 则可能破坏固定化酶的结构, 缩短固定化酶的使用寿命。 2）酶柱测定法 将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中, 在适宜的条件下让底物溶液以一定的流速流过酶柱, 收集流出的反应液。测定反应液中底物的消耗量或产物的生成量, 再计算酶活力。 测定固定化酶的活力要在恒定的流速条件下进行。 反应柱的形状和径高比都对反应速度有明显的影响, 必须固定不变。 3）连续测定法 利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定, 从而测定固定化酶的酶活力。 测定时, 可将振荡反应器中的反应液连续引到连续测定仪(如双束紫外分光光度计等) 的流动比色杯中进行连续分光测定；或者让固定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进行连续分光测定。 4）固定化酶的比活力测定 游离酶的比活力可以用每毫克( m g) 酶蛋白或酶R N A 所具有的酶活力单位数表示。 在固定化酶中, 一般采用每克(g) 干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。 在测定固定化酶的比活力时, 可先用湿固定化酶测定其酶活力, 再在一定的条件下干燥, 称取固定化酶的干重, 然后计算出固定化酶的比活力。也可以称取一定量的干固定化酶, 让它在一定条件下充分溶涨后, 进行酶活力测定, 再计算出固定化酶的比活力。 5）酶结合效率与酶活力回收率测定 酶在进行固定化时, 并非所有的酶都成为固定化酶, 总是有一部分酶没有与载体结合在一起, 所以需要测定酶