乳腺干细胞分离鉴定及催乳素对其分化影响的初步研究.docVIP

试验总思路图 的 试验流程图 实验试剂：双抗（血清（培养基DMEM/F12氢化可的松HE），转铁蛋白（DMEM/F12＋FBS（10%）EGF（20ng/ml）FGF（20ng/ml）E（5ug/ml）TS（1%）＋双抗（unit/ml） 冻存液：DMEM/F12(70%)FBS(20%)＋DMSO(10%) 实验方法： 解冻原代细胞卡式瓶，加入~5ml培养液，放入、%CO2培养中，情况更换培养液培养至~80%汇合时传至～三个卡式瓶，继续培养当张~80汇合时~8min，待有细胞脱离培养皿底时加入含有胎牛血清的基础培养基终止消化600rpm/min离心min，弃上清液，细胞加入适量冻存液均匀，放入冻存盒中，冰箱中冷冻h后取出，快速放入液氮中留种。一部分试验二中吹打均匀后进行。 实验二 乳腺干细胞的筛选[1~4] ： 试验试剂：/F12，B27，EGF，，25%胰蛋白酶—0.01%EDTA溶液 培养液：（%）10ng/ml）＋bFGF（10ng/ml）+HE（10ug/ml）＋胰岛素（5ug/ml）＋双抗（100unit/ml）＋肝素（： 实验一中得到的细胞细胞悬液，吹打均匀后使用200目细胞筛过滤得到单细胞悬液。将得到的单细胞悬液使用染色中细胞密度大于2ml，将细胞悬液加入于、%CO2培养中。密切注意观察，除去贴壁细胞死细胞。g/min离心更换培养液。可通过加入酶的方式除去。 一段时间后使用吸胚管将细胞团吸板中，此时的单细胞悬液即可视为初步筛选得到的乳腺干细胞。干细胞通过实验一所用方法大量扩增后冻存和用于进一步实验。 实验三干细胞的[5] 试验流程图： 试验a： 试验b： 试验试剂：DMEM/F12BS，EGF，FGF，胰岛素，氢化可的松，ITS，催乳素，双抗，Ⅳ型鼠尾胶原干细胞诱导为乳腺DMEM/F12＋FBS（10%）＋EGF（20ng/ml）＋胰岛素（5ug/mL）＋氢化可的松（5ug/mL）＋ITS（5ug/mL）＋催乳素(5ug/mL）00IU/ml） 乳腺干细胞诱导为乳腺肌上皮细胞培养液：DMEM/F12＋FBS（10%）＋β－巯 基 乙 醇（0.1mmol/L）＋bFGF（20ng/mL）＋双抗（100 unit /mL） 试验方法： a：乳腺干细胞诱导分化为肌上皮细胞实验二得到的干细胞接种到铺有胶原培养皿上60 mm培养皿中加入50 μg/mL的IV型胶原0.5 mL，规格的培养皿按此比例添加，4℃过夜，加入诱导分化培养液放入试验进行观察细胞形态，拍照记录。细胞出现预期细胞形态及出现后，的细胞裂解液（g/min，4℃离心15min。此时溶液分为3层，吸取上清约0.5mL，移至新的1.5mL离心管中。加入等体积异丁醇，室温静置20min，10000g/min，4℃离心10min，弃上清。随后加入75%乙醇1mL，混匀，5000r/min，4℃离心10min，弃上清，用75%乙醇再洗一次。室温干燥2~3min，加入适量适量无酶水溶解，并测定OD值。随后，按Super Script II cDNA合成试剂盒说明书进行下一步操作，合成cDNA，RT-PCR反应条件：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃。 进行特异基因片段扩增温度引物自己摸索。 %琼脂糖凝胶电泳检测目的基因。b：的乳腺干细胞为材料，接种到经过，鼠尾胶原的量与试验a按同比例添加。孔X104个细胞，先加入普通培养液，含有ug/ml催乳素的培养液继续，搜集细胞，提取总RNA，反转录为cDNA进行基因片段，分化基因ck19未分化基因cd24cd49f、cd29。 序列名称序列 5-3Ck19 GCAGATGACTTCCGCACCAA AAGCGAGCCTCCGTTTCC 参考文献参考文献-actin TACGGCTGCTTCTTCCTC GCCTGCCTCATCATACTCTT cd24 TGGGCTGTGGAACAGATTCA AGCATCAGTGTGTGACCATGT 根据NCBI检索得到的基因XM_003585775.2）后使用primer3.0 TACCGCTGACTTAGGGA 参考文献5和参考文献6 cd49f GTGGCTGCTTTACCTGTC CTTCCTTGCTTTCCGATG 参考文献5和参考文献6 试验四干细胞特异性基因的[5~9] 试验流程图 试验方法：实验二出的乳腺干细胞为材料，提取总进行反转录cDNA，以基因D49f、CD29、CD24为目标进行