克隆构建服务精讲.pptVIP

Novobio Custom Services克隆构建服务 Chaozheng.xie@ 2012.02.04 1 原理介绍 基因克隆是指通过体外DNA重组技术，将目的DNA经过切割与合适的载体连接，并导入受体细胞形成大量拷贝的过程。 目标客户 所有的分子生物学/细胞生物学的研究工作者 相关主要设备：摇床，无菌操作台，PCR仪 2 克隆服务简易图 3 目的基因获得的不同方式 PCR产物（针对TA克隆服务） RT-PCR产物（针对ORF克隆和RACE服务） 质粒（针对亚克隆和定点突变服务） 基因合成 4 克隆库产品及ORF克隆 原理在进行目的蛋白的表达、构建表达载体等实验时，通常需要获得一段目的基因。我们可以根据客户提供的已知参考序列设计引物，以总RNA为模板，获取客户需要的感兴趣的目的基因。 5 服务流程 客户提供：与参考序列物种一致的材料或总RNA： 1) 实验材料必须保证新鲜，请您采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂；2) 基因组DNA/总RNA无明显降解，总量大于5 mg。如果基因丰度较低或调取的基因较长，请您提供尽量多的材料。 总RNA的提取 以总RNA为模板通过RT-PCR扩增得到目的基因 目的基因的克隆及测序 目的基因亚克隆至表达载体中 我们提供：含有目的基因的质粒及菌种 6 亚克隆及载体构建 根据欲改造的已有载体性质、欲改造的结构进行方案设计，可完成已有载体MCS的改造，已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造； 可应客户要求将基因片段或者各功能元件片段亚克隆至各载体 7 载体构建类型 RNAi载体 慢病毒载体 腺病毒载体 基因表达载体 etc. 8 TA克隆服务 在PCR过程中，一般Taq酶扩增时可在PCR产物的3’端多加一个A，利用这一点，我们将PCR产物连接到5’突出末端带有T的载体。 9 基因合成服务 原理 人工化学合成寡核甘酸片段，通过片段拼接技术，将若干小片段拼接形成大的基因片段或者启动子等功能元件片段；适用于基因表达量不高、材料较难获取或处理、不同样本个体突变率较高等情况下的基因或功能元件调取；可以任意的调整基因中的密码子以适应不同的表达体系中的需要。 特点 有些基因很难通过PCR手段从生物体中获得，必须通过基因合成 可调整基因中的密码子使用，以适合表达体系的需要 10 服务流程 客户提供：提供所要合成的基因序列；如果客户需要克隆于特定载体中，需要提供该特定载体（客户所提供的载体必须经过明确地测序验证） 我们将对客户需要合成的基因全序列进行分析，检查基因内部是否含有重复序列和复杂的二级结构。根据序列的具体情况设计合成方案。 11 项目类型 Lead Time 成功率 基因合成，500 bp 15 days 90% 基因合成，500-1K bp 20 days 80% 基因合成，1K-2K bp 20-25 days 70% 基因合成，2K bp 30-40 days 90% 在得到客户确认后我们将立即进行单链Oligo DNA合成、DNA片段拼接等工作，然后把全长基因克隆于载体中，再通过DNA测序确认合成基因的正确性。 测序结果如果发现有错误位点，我们会采取相应的技术手段进行修复校对，保证整个序列的正确性。 我们提供：提供克隆有全长基因的质粒、菌株、测序的原始结果。 12 合成策略：1. oligo设计 2. PCR 3. 载体构建 1. 2. 3. 合成策略：1. oligo设计 2. PCR 3. 载体构建 我们的优势 免费序列优化服务：可以用来对基因序列进行优化，包括密码子选择、GC含量优化、RNA二级结构优化等等，极大程度地提高了目的基因的表达 对于较长的片段或基因结构较复杂的片段，将针对不同复杂基因的特点，采用长片段引物（90 base左右）和灵活的合成策略为您尝试最佳的结果。 经验丰富，交货迅速，严格执行服务协议 为客户严格保密 13 定点突变服务 14 通过PCR方法有效地向目的DNA片段中引入任何所需的变化，包括碱基的添加、删除、替换等。 15 1. 设计一对5‘端邻接，3’端方向相反的引物用以导入变异点。  2. 进行PCR扩增（使用高保真DNA聚合酶)。  3. DNA片段的末端平滑及5‘末端磷酸化反应。  4. 自身连接反应。  5. 质粒DNA转化，挑选变异体。   16 通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。 质粒提取服务 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子