蛋白质相互作用方法剖析.ppt

蛋白质相互作用研究方法简介 基因组序列测定→后基因组研究时代 编码功能蛋白的基因不到三万条 已知蛋白的功能，新基因的功能探索 蛋白质功能研究或蛋白质组学研究 蛋白质相互作用研究方法作为技术平台 蛋白在发挥作用时都不是孤立的， 而是相互联系的 一种蛋白的功能必须借助于其它蛋白的调节或介导。这种调节或介导作用的实现首先要求蛋白质之间有结合作用或相互作用。如果找到与已知蛋白有相互作用的其它蛋白（不管这种蛋白是已知的还是未知的），那么这种已知蛋白的功能研究有可能进入一个新的天地。对于新基因 情况也是如此。 Yeast two-hybrid System 酵母双杂交系统 原理 把报告基因整合到酵母细胞基因组中，并受转录因子 GAL4 的调控表达。一旦 GAL4 蛋白结合到报告基因调控序列相应的位点，则启动其表达。 实际应用中，把 GAL4 基因分成两个部分：DNA结合区（gal4 DNA binding domain, GBD）和激活区(gal4 activating domain, GAD）。分别把 GBD 和 GAD 构建到两个不同的载体上，并能表达相应的两个融合蛋白（GBD-X 和 GAD-Y）。 自激活作用检测： 　GBD-X和GAD 　GAD-Y和GBD 阴性对照 　GBD 和 GAD GBD-IL2和GAD-IL2R（例如） 阳性对照 然后把 GBD-X 和 GAD-Y 两种载体共转染到带有报告基因的酵母细胞中。当 GBD-X 融合蛋白中 X 蛋白与 GAD-Y 融合蛋白中 Y 蛋白发生相互作用时（或结合在一起时），就使得原本分开的 GBD 和 GAD 蛋白靠近并具有完整的 GAL4 蛋白的功能，从而能够激活报告基因的表达。 AD/library: A fusion of the GAL4 AD with a library cDNA/protein. DNA-BD/bait: A fusion of the GAL4 DNA-BD with a bait cDNA/protein. Yeast Phenotypes Ade–, His–, Leu–, or Trp– Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients. Ade+ Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to grow. His+ Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow. LacZ+ Expresses the lacZ reporter gene; i.e., is positive for β-galactosidase activity. Mel1+ Expresses the MEL1 reporter gene; i.e., is positive for α-galactosidase activity. 应用 一、筛选相互作用的蛋白 可用于对 cDNA 文库的筛选。把你要研究的蛋白亚克隆到 GBD 载体上，作为“诱饵”蛋白。把文库蛋白基因亚克隆到 GAD 载体上。 假阳性: 人为转染重组体 artificial 验证实验:进一步验证实验证明其在生理情况下是否真的有作用。 二.确定参与结合作用的 domain 或 motif 随机缺失，制备一系列缺失体。 对已知的 domain 或 motif 进行缺失。 对磷酸化位点进行点突变，检测这些磷酸化位点是否参与调节蛋白质的结合作用。 Pull Down Assay 细胞外蛋白质相互作用 比较直接地检验蛋白质分子之间存在的物理的相互作用 GST-pull down assay HIS-pull down assay 原理 将目的蛋白基因克隆到带有GST或HIS基因的原核表达载体中，进行原核表达，得到GST-X或HIS-X融合蛋白。 把GST-X挂到Sepharose beads上, 如是 HIS-X 则挂到Ni-chelated agarose上。 加入另一种蛋白Y 复合物 GST-XY (HIS-XY) Wash, elution, detection by SDSand western blotting.