第二章基因工程的基本原理研讨.pptVIP

D 基因工程的支撑技术;A 重组DNA技术的理论基础;B 基因的分子生物学;C 基因工程的基本原理;D 基因工程的支撑技术;? ? ? ?;;;碱基;核苷酸的基本组成;DNA的一级结构与功能;DNA的二级结构与功能;;;;tRNA ;;; 热变性中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度称为DNA的熔点或熔解温度（Tm）。;;;;;;;;2.3.1 生物信息的传递; ? 复制的起始 (initiation) ? DNA链的延伸 (elongation) ? 复制的终止 (termination);;;;*;;真核生物基因的表达调控;真核生物基因表达调控的特点和种类 真核生物DNA水平上的基因表达调控 真核生物转录水平上的基因表达调控 顺式作用元件和反式作用因子 真核基因他水平上的调控 RNA的加工成熟、翻译水平的调控、翻译后水平的调控 ;;;;溶菌途径 溶源途径;第三节 基因工程的支撑技术;基本原理 (PCR—Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应) 一个DNA经n次扩增后, 一个DNA分子可变为2n个分子DNA扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物 。;PCR原理示意图;锚定PCR（Anchored PCR，A-PCR）或称RACE;反向PCR （inverse PCR） 该法可用于扩增已知 序列两侧的未知序列;;反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 主要用于mRNA的PCR扩增 ;RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time?PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative?PCR)或者RTQ-PCR(real-time?quantitative?PCR)。;实时荧光定量PCR （Real-time PCR） ;;;在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 ;加端PCR（Add-on PCR）;错配PCR（mismatched PCR);重组 PCR（Recombinant PCR）;分子杂交技术;原位杂交(in situ hybridization) i. 原位菌落杂交 ii. 原位噬菌斑杂交 iii. 原位细胞杂交 iv. 原位组织块杂交;转移杂交或印迹杂交(blotting hybridization) 先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体基质上，与探针杂交。该法可检测??感兴趣分子的分子量。用于转移的方法有： i. 扩散法 ii. 毛细管法 iii. 电泳转移法 iv. 真空转移法 夹心杂交法(sandwich hybridization);分子杂交的一般程序;探针的制备;标记探针的制备 链标记法 i. 切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-dCTP) ii. 随机DNA引物延伸法 ds-DNA→ss-DNA-(6n,t)→Klenow片段+dNTP(32P) iii. 反转录法 mRNA+dNTP(32P) →cDNA（标记） iv. 转录法 含有待标记DNA片段的重组质粒+NTP(32P)→→RNA（标记） SP6聚合酶 v. 引物延伸法 含待标记DNA的单链DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)→待标记DNA链 vi. T4 DNA聚合酶法 ds-DNA→T4 DNA聚合酶, 无dNTP→3’-5’外切酶活性→加入dNTP和标记核苷酸→新合成链（32P）;末端标记