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0.5Gy X 线通过多重信号通路促进成骨细胞增殖分化 中文摘要 0.5Gy X线通过多重信号通路促进成骨细胞增殖与分化 中文摘要 骨的生长、发育及内稳态依赖于成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收之间平 衡。成骨细胞的主要功能是在骨形成及骨折愈合过程合成分泌大量细胞外基质。众所 周知，高剂量辐照对骨组织常具有不良影响，包括放射性骨坏死、骨硬化、骨折及骨 矿丢失。然而，低剂量电离辐射对骨组织的生物学效应及分子机制目前仍缺乏相关研 究。骨科病人更经常接受到电离辐射，如X线摄影、计算机断层扫描或术中透视，辐 射暴露通常为低剂量水平。我们课题组前期研究表明，低剂量X线照射促进大鼠骨折 模型愈合过程骨痂的矿化，同时不同水平的低剂量X线在体外对成骨细胞的增殖和分 化具有不同影响。但是，目前对于低剂量X线对骨组织刺激兴奋效应的潜在机制仍不 清楚。在本研究中，我们进一步探讨低剂量X线辐照对成骨细胞增殖、分化及骨折愈 合的影响特征，并在此基础上对相关信号通路的调控作用深入研究，以阐述低剂量X 线对骨组织刺激兴奋效应的分子机制，为更好的理解低剂量X线对骨组织的生物学效 应提供一定理论基础。 一、0.5Gy X 线照射促进成骨细胞增殖、分化及骨折愈合 电离辐射对成骨细胞的影响目前仍存很大争议，且具体分子机制仍不是很清楚。 为了进一步研究不同剂量X线对成骨细胞的影响，本部分研究分别应用0.5Gy和5GyX 线照射成骨细胞和骨折模型。通过CCK-8，Brdu掺入实验及Sub-G1实验研究对成骨细 胞增殖的影响，同时应用Real-time PCR及Western-blot检查骨分化相关基因的表达情 况。组织学检查评估骨痂的形成及改建过程。结果显示0.5Gy X线明显促进成骨细胞 增殖、分化及骨折愈合。具体表现为，0.5Gy X线增加MC3T3-E1细胞活性及DNA合 成，而5GyX线明显抑制细胞活性及增殖，增加细胞的凋亡。Western-blot检测显示 MC3T3-E1细胞在电离辐照后骨分化相关标志物蛋白表达水平发生动态变化，包括 Col1、ALP、OCN、Runx2、Osterix。在大鼠股骨闭合骨折模型中，0.5GyX线能促进 骨折愈合过程，骨痂中PCNA阳性细胞数量、软骨形成及骨痂面积比对照组明显增加， 膜内成骨及软骨内成骨进程加速，同时骨形成标志基因Col1α1、Col2α、ALP、OCN、 Runx2、Osterix的mRNA表达水平增高。虽然在5Gy照射组骨痂组织中一些骨形成标 I 中文摘要 0.5Gy X 线通过多重信号通路促进成骨细胞增殖分化 志物基因的表达也有增高，但是骨痂形成及骨折愈合时间较对照组及0.5Gy组明显延 迟，可观察到胶原纤维老化。因此，低剂量的X线照射对成骨细胞具有一定刺激兴奋 效应，可增加成骨细胞的增殖、分化及骨折愈合。 二、低剂量 X 线照射对 MC3T3-E1 细胞基因表达谱的影响 为了探讨低剂量X射线对成骨细胞基因表达谱的影响及相关分子机制。 MC3T3-E1细胞在低剂量X线照射后，继续诱导成骨培养7天，收集样本后采用罗氏 NimbleGen小鼠表达谱芯片进行检测。经过RNA抽提纯化和完整性检测后，取5μgRNA 进行标记杂交，GenePix Pro 6.0 软件扫描获取图像并应用NimbleScan 2.5软件进行数 据分析。应用T检验筛选出p0.05，两组之间差异表达在1.3倍以上的基因为判定差异 基因。结果显示，成骨细胞在低剂量X射线照射后，共发现1412个差异基因，其中559 个上调，853个下调。差异基因中促进成骨细胞分化、钙化，及一些生长因子及受体 基因上调，同时调控细胞外基质、局部粘附、细胞骨架和血管形成的基因也明显上调。 GO和Pathway分析结果显示细胞粘附、细胞周期及调节、Wnt信号、NF-κB信号、细 胞骨架、TGF-?信号、血小板生长因子受体信号基因明显富集。由此可见，低剂量的 X线辐照对成骨细胞的生物学效应的复杂性，其促进成骨细胞分化和矿化可能与细胞 外基质-局部粘附-细胞骨架途径、Wnt信号通路及生长因子相关信号通路有关。 三、0.5Gy X 线照射通过 Wnt/?-Catenin 信号通路促进成骨细胞分化 为了进一步研究Wnt信号通路在0.5GyX线促进