第4讲核酸分子杂交技术资料.ppt

核酸分子杂交技术 （DNA/DNA or DNA/RNA）;核酸分子杂交技术： 具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下, 可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链;主要内容;核酸分子杂交技术： 1968年华盛顿卡内基学院（Carnegie Institute of Washington）的Roy Britten 及其同事发明的;变性; 一、DNA变性与复性;2、变性的方法： 1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸 分子链间的氢键断裂。 3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂;3、核酸溶液变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加 (利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程);4、DNA变性曲线 AT区先解链，GC区后解链，阶梯式曲线，当达到一定温度时，DNA双螺旋几乎是同时解开的;5、GC含量与Tm值(melting temperature)之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3;（二）复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。;;3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）; 二、影响杂交的因素 1、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1-0.5μg, 浓度过高影响杂交效率;2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20-25℃ （2）RNA/DNA 或 RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值 （原位杂交时，杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而 引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落） （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃ ;3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定 （当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度） ;4、甲酰胺： 甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定 （1）当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42 ℃杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交 ;5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度，Cot?与反应体系中核酸复杂性成正比 （Cot1/2值越大，复性速度越慢） （2）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性 ;6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉 ;膜上印迹杂交 原位杂交;核酸分子杂交实验步骤：;2、常用的印迹转移方法（Southern blot） 1）毛细管虹吸印迹法;2）电转法;3、同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上;3）真空转移法;Southern DNA印迹杂交;Southern DNA印迹杂交 使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。 E. Southern于1975年首先设计出来的，故又称： Southern blot ;Southern 印迹杂交的主要流程 1）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段;2）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，