骨髓间充质干细胞移植对血管性痴呆大鼠行为学及钙通道影响的研究.pdfVIP

贵阳医学院 2014 届硕士研究生论文 骨髓间充质干细胞移植对血管性痴呆大鼠行为学及钙通道影响的研 究 生物化学与分子生物学专业 研究生：井 沆 导师： 官志忠 教 授 肖 雁 教 授 摘 要 【目的】 通过复制血管性痴呆（Vascular Dementia, VaD）大鼠模型并对其进行 行为学和钙通道相关信号通路检测，探讨 VaD 大鼠钙通道信号通路的改变，分 析其改变引起记忆认知障碍的可能机制。同时进一步探讨骨髓间充质干细胞 （bone mesenchymal stem cells, BMSCs）移植对 VaD 大鼠认知功能的改善和钙通 道以及与钙通道相关信号通路的影响机制，为 BMSCs 的临床应用提供适用性资 料。 【方法】 （1）通过贴壁筛选的方法分离、培养 BMSCs，至第五代细胞纯化后， 用流式细胞仪对所培养 BMSCs 进行流式表面抗原鉴定，成纤维生长因子（basic fibroblast growth factorbfic，bFGF）和丁羟基茴香醚（Beta Hydroxy Acid，BHA） 诱导 BMSCs 分化为神经元细胞，并对诱导后的细胞，进行神经巢蛋白(Nestin)、 神经元特异性烯醇化酶(Neuron speeific enolase ，NSE)表达的免疫组化鉴定。诱 导后的 BMSCs 于移植前 24h 在其培养液中加入浓度为 10μmol/L 的标记物 5-溴 脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU)，离心收集标记后的 BMSCs， 备用。（2）提前进行大鼠水迷宫智力筛查，大鼠随机分为对照组和模型组，模型 组用改良 Pulsinelli’s 四血管阻断法复制 VaD 模型，对照组只分离椎动脉和颈总 动脉，不进行椎动脉凝闭和颈总动脉的夹闭。30 天后筛选模型组中认知功能障 碍的大鼠再分为模型对照组和干细胞治疗组。干细胞治疗组将诱导后被 BrdU 标 记的 BMSCs 细胞悬液通过脑立体定位仪注射到大鼠侧脑室，对照组和模型对照 组注??等量培养基。细胞移植 30 天后进行水迷宫行为学测试，各组大鼠断头取 脑，制备石蜡切片，苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）染色观察大鼠大脑海 马区病理变化。（3）免疫组化染色方法检测移植的细胞在大鼠脑组织的表达情况； 检测血浆和海马组织一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase, NOS）活性和 NO 含量； 提取血细胞和海马组织总 RNA，Real-time PCR 方法测定钙调蛋白（Calmodulin， CaM）、钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ（Calcium / calmodulin -dependent protein kinaseII, - 1 - 万方数据 贵阳医学院 2014 届硕士研究生论文 CaMKII）和 NOS mRNA 表达含量；提取海马组织总蛋白，BCA 法进行蛋白定 量，用蛋白免疫印迹 (Western Blotting) 法检测钙调蛋白依赖性激酶（CaMKⅡ） 和与钙通道相关的 NOS 蛋白酶的表达情况。比较对照组、模型对照组组