亚抑菌浓度抗生素对EcoliPA接合反应的影响.pdfVIP

众所周知，抗生素具有抑制乃至杀灭细菌的作用，那怎么推测它具有促进耐药基因水平转移的作用呢?涫嫡獠⒉幻?埽?蛭?股?胤⒒幼饔玫那疤崾且4锏接行б?物浓度及作用时间。通常抗生素对细菌的作用具有浓度和时间依赖性，所以为达到抑制甚至杀灭细菌的作用，临床应用抗生素时需根据药物代谢动力学参数定时定量给药，以维持抗生素浓度大于最低抑菌浓度????然而，实际上有多种因素导致到达感染部位的抗生素仅达到“亚?????甅???平，其中不规范用药是一个重要原因；其次，细菌可形成了特殊结构，比如?形成生物膜抵御抗生素；第三，人体器官的特殊结构，如血脑屏障可阻止某些药物进入脑室；第四，因药物在不同组织器官中的分布情况不同，以及受感染组织的血液供应欠佳等：第五，细菌虽然被人体吞噬细胞吞噬，但因机体免疫力较低而未被杀灭，反而吞噬细胞成为了细菌的庇护所。在亚???剑?股?厣泵鸩涣讼妇??本课题拟从临床常用抗生素的亚抑菌浓度入手，探索亚抑菌浓度的抗生素在铜绿假单胞菌接合反应中所起的作用及相应的分子机制。本课题拟从以下三方面展开研究：??紫扔呕?翁庾榍捌诮?⒌墓┨寰鶨．??与受体菌?的接合模型，使之适合抗生素的处理研究；??鄄毂冉峡股?囟怨┨?菌及受体菌的不同影响，然后研究亚??ǘ瓤股?囟韵妇?雍戏从Φ挠跋欤??采用转录组测序技术??—??研究亚??股?刈饔孟孪妇?牟钜毂泶锘?颍??选接合反应相关基因，进行相关通路的功能分析，并用荧光定量??橹ぷB甲檠?的结果?】，从而全面阐明亚??股?囟韵妇?雍戏从Φ挠跋臁?方法：??呕?雍戏从δＰ?①供体菌与受体菌供体菌??????畃?????芴寰鶳??擅拦?耷兴固卮笱??????????教授赠予。②滤膜杂交法与液体杂交法的比较滤膜杂交法与液体杂交法在接合前增菌、药物处理等步骤是相同的，不同点体现在供体菌与受体菌定量混合后，前者放在滤膜上杂交?，后者放在液体环境下杂交?，最后计算接合效率。③接合时间接合时间的选择需要考虑影响实验结果的因素与整个实验的周期，前期处理，??续洗膜涂板，抗生素筛选，接合子长出后数板计数的时间等，尝试了?、?、?。④构建报告基因荧光检测法与数板菌落计数法的结果荧光检测法用的是双质粒抑制系统，接合前不发光，接合后抑制性质粒丢失从而接合子中的质粒发光。菌落数板计数法用抗生素平板筛选接合子，??笫?寮剖??到的作用。???????琈??????????? 合子的数量。⑤接合相关的影响因素主要考虑滤膜上的接合菌量、洗膜时间和稀释倍数这?鲆蛩兀?杓屏剿?饺??素正交试验进行实验。??股?氐难≡窦按?矸桨?根据美国临床实验室标准化委员会???指南的推荐，筛选临床使用的肠杆菌科与铜绿假单胞菌的??级药物，然后根据市场提供的抗生素标准品的情况选用替卡西林、左氧氟沙星、环丙沙星、妥布霉素、美罗培南和头孢吡肟这六种抗生素。因接合转移的主要元件在供体菌内，并经过试验的验证，实验中选择用抗生素处理供体??鄄炜股?囟怨┨寰?淖饔眉捌涠越雍戏从Φ挠跋欤??髯钍实难荕?浓度与处理采用宏量肉汤稀释法与微量肉汤稀释法确定不同抗生素的亚抑菌浓度，绘制亚抑菌浓度抗生素处理的供体菌的生长曲线。因为抗生素处理的时间不同可分为两组：①在供体菌生长到对数期再用抗生素处理供体菌?、?；摇菌的总时问固定为??虎?从初始摇菌即用抗生素处理?、?、??还鄄旖雍闲?实谋浠????B甲椴庑?采用??猻?技术对不同亚抑菌浓度抗生素处理的供体菌?甤???????????腞?进行测序和后续的功能性分析，包括亚抑菌浓度抗生素对接合的影响，对细菌的其它的调节作用及其可能产生的对宿主的影响。?畄??觳釫??接合相关基因的表达采用不同亚抑菌浓度环丙沙星与左氧氟沙星处理供体菌?、?、???崛??逆转录为??。采用荧光定量??觳饨雍舷喙鼗?騮??畉??筒慰蓟?騛??的表达。结果：??茨な本?宓南∈捅妒?怯跋旖雍戏从Φ闹饕R蛩兀??⑹芴寰?慕又至亢拖茨な?问是次要因素。接合实验的最佳条件为：洗膜时菌体的稀释倍数为??叮?四ど瞎??受体菌的接种量为??，洗膜时间为??。接合反应的最适时间为?。??股?氐拇?恚?分别用替卡西林、左氧氟沙星、环丙沙星、妥布霉素、美罗培南、头孢吡肟来处理供体菌，我们以低于最低抑菌浓度的五个相对稳定的??递减的亚抑菌浓度????????／?、???和???为选择标准，留取了每个抗生素处理供体菌的五个亚抑菌浓度的样本做接合实验，经过计算，环丙沙星与左氧氟沙星这两种抗生素随着亚抑菌浓度的梯度变化，接合效率呈现出了规律性的变化。然而在供体菌生长到对数期时再用抗生素处理供体菌?或?，未能像抗生素处理??茄?氏殖龉媛尚缘谋浠??菌?????????。时问?? ≡窕繁?承怯胱笱醴?承谴?砉┨寰??诳股?卮???????时收取菌体做接合实验，观察接合效率，结果是：随着