12.4核移植技术与动物克隆1答案.pptVIP

12.4 动物克隆技术; 早期动物克隆方法是采用胚胎分割，即用显微术将未着床的早期胚胎一分为二、一分为四或更多次地分割，然后分别移植给受体，妊娠产生多个遗传性状相同的后代的克隆方法，由此发育成的动物个体，属最简单的人工动物克隆方式。 随着对胚胎分割局限性认识及克隆技术的发展，人们开始研究核移植技术并取得成功，产生克隆动物的效率比分割技术大大提高，也就基本上替代了利用胚胎分割生产克隆动物的研究和开发。; 胚胎分割的原理;分割胚胎发育阶段与透明带的关系 胚胎发育早期，透明带及其完整是必要的。 胚胎分割的次数： 操作液：大多数研究都用含10%-20%血清PBS液。 动物种类：动物种类不同，其胚胎的生物学特性就有所差别，不同动物胚胎分割时的难易程度也不同。 移植半胚数与移植部位：受体妊娠率随着半胚移植数的增加而提高。; 细胞核移植的原理; 哺乳动物胚细胞核移植的原理是早期胚胎细胞具有全能性,它包含个体的全套遗传信息。 已分化的体细胞在特定的条件下经过去分化也具有全能性.已分化细胞具有全能性的前提条件是这种细胞在体外进行诱导进入休眠状态.; 细胞核移植技术的类型;1.胚胎细胞核移植： 将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞球，在电流的作用下，使单个细胞与去除染色体的未受精的成熟的卵母细胞融合，发育成胚胎后，移入受体妊娠产仔。 原则上一枚早期胚胎有多少个细胞，通过这种方法，就可以克隆出多少个个体。还可以细胞反复克隆出更多的胚胎，产生更多的克隆动物。; 中国台湾省畜产试验所吴明哲研究员利用此法于1991年3月克隆出5头小猪。他用的就是细胞反复克隆法。如今经三次产仔实验，已经证明克隆个体也能繁殖后代。吴教授成功制成了九个胚胎，再将每一个胚胎复制成4个共36个，分别移入3头母猪的卵巢中，怀孕5个月后产下8头小猪，死去2公1母，存活1公4母。他们认为：在性别的复制上，雄性难于雌性。 1990年5月，西北农大畜牧所张涌教授等人经过两年的时间 ，利用细胞核移植的方法，得到了世界上第一只克隆山羊。有人认为山羊胚胎的基因在两细胞时便被激活，由于时间太早，因而使得核移植比较困难。; 1995年10月，在西北农业大学畜牧所窦忠英教授主持下，首批克隆了我国6只小猪。 1996年3月，中国农业科学院畜牧所朱裕鼎研究员主持克隆牛的实验成功。 1996年12月14日和21日，中国首批克隆小鼠在湖南医科大学诞生。 根据这些实践了解到：哺乳动物的胚胎细胞在分裂成8细胞以前，所有的单卵裂球均为全能细胞，即每个卵裂球均能表达此个体的全部基因。 根据这一理论，以鼠为模型进行实验： 1）从昆明白鼠输卵管中取成熟卵母细胞，去其细胞核； 2）自L5黑鼠2-8个细胞的胚胎中取一单卵裂球，将注入去核卵母细胞；;3)将移核后的新胚胎移入昆明白鼠输卵中，孕育20天； 4）将此种胚胎移入母鼠子宫孕育； 12月14日，3只遗传特性为L5黑毛小鼠出生。12月21日，又有3只小鼠出生，不过其可一只呈褐色。这说明昆明白鼠卵母细胞质对黑鼠细胞核有一定的影响，它为进一步研究细胞核和细胞质的相互关系建立了一个很好的模型，具有重要的生物学意义。 2.胚胎干细胞核移植 将胚胎或胎儿的原始生殖细胞经过抑制分化培养后，细胞数量增多，单细胞却不分化。因此，每个细胞仍然具有细胞全能性而发育成个体的能力，这样的细胞被称为胚胎干细胞系。从理论上讲，可以比胚胎核移植产生更多的动物个体。 目前仅有小鼠分离克隆出胚胎干细胞系并成功克隆出成体鼠。而牛、猪、羊、兔只分离胚胎干细胞系，却无成功个体产生。 ;3.胎儿成纤维细胞核移植 从妊娠早期胎儿分离出胎儿成纤维(fibroblast)细胞，采用细胞核移植方法克隆出胚胎，要移植受体后，妊娠产仔，克隆出动物个体。1996年，英国报道选用此法克隆出3只山羊。 4.体细胞核移植 将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，克隆出胚胎，经移植至受体妊娠产仔，克隆出成体动物。1996年，英国的克隆羊”多莉”即用此法产生。具体克隆过程如下： 1）取处于后三分之一妊娠期的6岁母绵羊（芬兰多塞特白品种绵羊）的乳腺细胞作核供体细胞，用”饥饿法”使其进入休眠状态而使全部基因具有活性。 ;2）注射促性腺激素GN促使母羊（苏格兰黑面母绵羊）排卵， 28-33h取其未受精卵快速去核，放入10％FCS（小牛血清）、1％FCS和0.5％FCS连续5天，饥饿使其进入G0期作为受体细胞。 3）乳腺细胞注射GN34-36h后与无核卵放入同一培养皿可