现代分子生物学技术重点.ppt

分子生物学研究方法; ;;（一）三大成就 ：;2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；;3. 50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。;（二）两大技术保证：;;二、 DNA操作技术?;DNA和RNA被称为多聚阴离子（polyanions），核酸分子放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。;;琼脂糖凝胶电泳;聚丙烯酰胺凝胶电泳;凝胶类型及浓度 ;在紫外线的照射下结合溴化乙锭（简称EtBr）的DNA分子发出荧光,每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA也可以被清晰地检测出来。;称样;取样;结果分析;（二） 核酸的分子杂交;不同温度下DNA的构型变化; 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“印迹杂交”。; 材料：尼龙滤膜 、硝酸纤维素滤膜 、二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）;Southern Blotting的过程 （1）碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA （2）通过电泳液的移动转移胶中的DNA （3）固定胶中的DNA （4）预杂交和杂交（放射性和荧光检测） （5）结果检测;常用的荧光染料：C5、C3等 ;2.Northern blotting（RNA印迹技术） 是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。;3.Western blotting（蛋白质杂交技术）;Step 1.靶蛋白于第一抗体（一抗）反应;4、原位杂交（in situ hybridization ）;将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 特点: 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态;核酸原位杂交的基本步骤;检测重组体克隆的菌落杂交技术;5、探针的标记;缺口平移法;当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3‘羟基末端。 同时该酶具有从5‘→3’的核酸外切酶活性,能从切口的5‘端除去核苷酸。 由于在切去核苷酸的同时又在切口的3‘端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。 最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。 ;随机引物法;（2）单链DNA;从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 ;从RNA合成单链cDNA探针 ;;所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。 提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。 处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。;步骤：;2.与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。 3.立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。 4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复 5. 涂布于选择性培养基中分离转化子。;（四）基因扩增;??1、 基本原理 ：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。;②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；;靶序列;第一次PCR 循环的结果是产生两个靶序列的复制。;1 cycle = 2 Amplicon;2、PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+;（2）DNA 聚合酶;(3)镁离子浓度: Taq酶活性需要Mg2+ ，Mg2+浓度过高导致非特异扩增，一般常用1.5mmol/L;PCR仪;（五） 核苷酸序列分析;不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来;AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’;AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’;反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离. 这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基. 电泳结构通过显色指示.;过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影（该法亦适合mRNA的序列分析） 。 GC富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）