姜黄素衍生物C213抑制线粒体Hsp90功能及抗白血病作用.pdfVIP

目录 中文摘要5 ABSTRACT8 常用英文缩写词9 第一部分前言10 1. 立题依据11 2. 研究背景和现状12 3. 论文研究目标14 第二部分材料与方法16 1. 材料16 1.1 实验仪器16 1.2 细胞株16 1.3 主要化学及生化试剂17 1.4 主要试剂的配制17 1.5 细胞培养材料18 1.6 抗体18 1.7 SDS电泳材料18 1.8 转移与印迹材料18 2. 实验方法19 2.1 细胞的传代、冻存和复苏20 2.1.1细胞的传代20 2.1.2细胞的冻存20 万方数据 2.1.3细胞的复苏20 2.2 MTT法测定体外抗肿瘤细胞作用21 2.3 线粒体蛋白的提取21 2.4 流式细胞仪检测22 2.4.1细胞周期分布的检测22 2.4.2细胞凋亡检测23 2.4.3线粒体膜电位的检测23 2.5 蛋白浓度的测定24 2.6 免疫共沉淀25 2.7 蛋白样品的SDS电泳26 2.8 Western Blotting26 2.9 统计学处理27 第三部分实验结果28 1. C213对肿瘤细胞增殖的抑制作用29 2. C213对白血病细胞中Hsp90分子伴侣功能的影响30 2.1 C213对热休克相关蛋白表达的影响31 2.2 C213对Hsp90客户蛋白激酶活性的影响32 3. C213诱导白血病细胞进行线粒体凋亡33 3.1 C213对白血病细胞线粒体膜电位的影响34 3.1.1不同浓度C213对线粒体膜电位的影响34 3.1.2 C213对白血病细胞短时间作用对线粒体膜电位的影响35 3.2C213对K562和HL60细胞状态分布的影响37 万方数据 3.3 C213对白血病细胞Caspase凋亡途径的影响38 4 C213对线粒体Hsp90 的影响39 5 C213对白血病细胞周期的影响42 5.1 C213对白血病细胞周期调控因子的影响42 5.2 C213对白血病细胞周期分布的影响43 第三部分讨论44 参考文献48 综述54 万方数据 摘要 目的：研究姜黄素衍生物C213干扰线粒体Hsp90功能和抗白血病作用。 方法： 1. 利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测C213 对 K562、HL60、MCF-7、 SMMC-7721、HT-29、SW620、CNE2、SGC7901和KB等肿瘤细胞的增殖抑 制作用。 2. 通过westernblot法和免疫共沉淀法对比C213与姜黄素Cur对热休克相关蛋 白和Hsp90客户蛋白表达量的影响，来考察C213对白血病细胞中Hsp90分 子伴侣功能的影响。 3. 采用JC-1染色K562和HL60细胞，应用流式细胞仪来检测C213对白血病 细胞线粒体膜电位影响；采用westernblot方法，考察C213对K562和HL60 细胞Caspase凋亡途径的影响；采用AnnexinV/FITC凋亡试剂盒，应用流式 细胞仪检测C213对K562和HL60细胞状态分布的影响。 4. 应用线粒体蛋白提取试剂盒，提取K562和HL60细胞的线粒体蛋白，用各细 胞器的标志蛋白检测线粒体蛋白的纯度；应用免疫共沉淀法，以CypD抑制 剂环孢菌素CsA和经典的胞浆Hsp90抑制剂为对照，考察C213对线粒体蛋 白中Hsp90-CypD复合物的影响。 5. 采用Westernblot法检测C213对K562和HL60细胞周期蛋白因子的影响； 通过PI染色，用流式细胞仪检测C213 对白血病细胞周期分布的影响。 结果： 1. 姜黄素衍生物C213在体外能抑制K562、HL60、MCF-7、SMMC-7721、HT-29、 SW620、CNE2、SGC7901和KB等细胞的增殖，C213 处理肿瘤细胞48小 时后，MTT法测得IC50值在 1-10μM之间，对白血病K562和HL60 的效果 最好，分别为1.01和0.87μM。 2. 用K562肿瘤细胞裂解液，对Hsp90进行免疫共沉淀，与对照组相比，可引 210 Hsp90 Akt P Bcr-ab C213 0.5,1, 起与 结合的客户蛋白 和 的含量下降。通过 （ 2μM）和Cur （2.5,5,10μM）分别处理K562细胞24h后，免疫印记显示细 Hsp70 Hsp90 p23 p60HOP 胞中的 的含量上升， 、 和 的蛋白含量无明显变化， 万方数据 同时细胞中的Hsp90客户蛋白Bcr-Ab 、Akt 的表达下降，并且呈剂量依赖关 C213 Hsp90 Cur 系。根据实验结果推测 对 分子伴侣功能抑制的作用与 相似， 并且活性要强于Cur。MG132是一个常用的蛋白酶体抑制剂，可以逆转由蛋 白酶体途径引起的蛋白的降解，用C213作用于K5622h后，再加入MG132 共同孵育2h。从免疫印迹