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离心技术 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 内容 离心技术 概念：是利用离心机的转子高速旋转时产生的强大的离心力，使置于该旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的目的。 是用于分离、纯化细胞、病毒、蛋白、核酸和酶的最方便最有效的工具。 离心技术基本原理 相对离心力relative centrifugal force（RCF） 由于过程在离心中微粒的质量往往不需要知道，因此实际应用时往往是相对离心力，它代表了离心力与该微粒所受重力的比值。 离心技术基本原理 沉降系数sedimentation coefficient（S） 颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。 离心分离的常用方法-1 沉淀离心法：是指介质密度约1g/mL，选用一种离心速度，使悬浮溶液中的悬浮颗粒在离心力的作用下完全沉淀下来。 差速离心法：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分步分离的方法。 离心分离的常用方法-2 密度梯度区带离心法 ①速率区带离心法：具有不同沉降速度的粒子在离心力作用下，各自以一定的速度沉降，离心后不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层，从而在密度梯度介质的不同区域上形成几条分开的样品区带的方法。 离心分离的常用方法-3 ②等密度区带离心法：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移动到它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）, 形成几条不同的区带。 离心机的分类-1 制备型离心机 主用于对不同密度，不同形态的物质微粒进行分离提纯。按转速高低可分为： 低速离心机：最大转速6 000rpm左右，最大相对离心力近6000×g。 用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒。 高速离心机：转速最高达25 000rpm，最大相对离心力为89000×g。 用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等。 超速离心机：超速离心机转速可达50 000～80 000 rpm以上，相对离心力最大可达510000×g。用途：亚细胞器分级分离，并用于蛋白质、核酸分子量的测定等。超速离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成 。 离心机的分类-2 分析型离心机 短时间内、用少量样品就能够确定生物大分子是否存在，其大致的含量，计算生物大分子的沉降系数，结合界面扩散，估计分子的大小，检测分子的不均一性及混合物中各组分的比例，测定生物大分子的分子质量，还可以检测生物大分子的构象变化等。 分析型离心机都是超速离心机。 离心机操作步骤 准备、检查 明确最大转速，需低温要提前制冷 适宜加样量 约管的2/3体积 配平、对称放置 一定要严格执行 离心过程留意观察、不能随意打开盖门 离心完毕将转头和仪器擦干净 使用完毕后登记仪器使用登记本 离心操作注意事项 及其维护保养 离心机如有噪音或机身振动时，应立即切断电源，即时排除故障。 离心管必须对称放入套管中，防止机身振动，若只有一支样品管另外一支要用等质量的水代替。 启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。 分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动。 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 生物化学与分子生物学实验教学中心 3 离心技术的原理 1 离心分离的常用方法 2 离心机的种类 离心机的使用与注意事项 4 3 离心力 Centrifugal force (Fc ) 物体作圆周运动时形成的一种迫使物体脱离圆周运动中心的力。 离心技术基本原理 离心力 Fc = ma = mω2r m：为沉降粒子的质量ω: 旋转角速度  r : 旋转体离旋转轴的距离 (rad/sec) n：转子每分钟的转数(rpm或r/min) RCF的单位: 重力加速度g （980cm/s2）,或数字乘“g”来表示。 一般情况下低速离心用rpm表示，超速离心则以g表示。 沉降系数与颗粒的大小、形状、密度、介质密度和粘度等有关，用S表示，1S=1×10-13秒。当生物高分子或亚细胞结构的化学组成或分子量不了解时，常用沉降系数来描述其结构特征，如1.6S、23S和70S核蛋白体RNA等。沉降系数越大，相对分子量越大。 差速离心法示意图 速率区带离心法示意图 等密度区带离心法示意图 例如25 000×g，则表示相对离心力为25 000，即作用在被离心物质上的离心力是日常地心引力的2.5万倍