蛋白质核酸沉淀杨解决方案.pptVIP

3、钙盐沉淀法 核酸提取液 10%氯化钙 钙盐形式 1/5体积的乙醇 DNA钙盐沉淀 4、选择性溶剂沉淀法 ①在核酸提取液中加入氯仿/异戊醇或氯仿/辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿/水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。 ②在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都进入水层，而蛋白质沉淀于苯酚层中被分离除去。 ③在DNA与RNA的混合液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA而与留在溶液中的RNA分离。 * “陈化”处理（小晶体溶解，大晶体生长） * * * * * 早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。 在蛋白质溶液中加入中性盐后会压缩扩散双电层、降低ζ电位，即中性盐既会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。 * 图7 pH4.8时人白蛋白在乙醇-水溶液中的 * 方法二 各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度 以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线 蛋白质量(mg)或酶活力 硫酸铵饱和度％ 蛋白质量(mg)或酶活力 硫酸铵饱和度％ KS分段盐析法 Β分段盐析法 在一定pH、温度条件下，改变离子强度。适用于早期粗提阶段的分步分离。 在一定离子强度下，改变pH、温度。适于后期分离纯化和精制。 1）注意饱和度表中规定的温度； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化； 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心； 4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓； 5）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用前需用氨水或硫酸调节至所需pH。 6、注意事项 蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性，依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。 二、等电点沉淀法 （1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒 （4）蛋白质对低pH 敏感，易失活 未沉淀蛋白质的分率 pH对大豆蛋白质溶解度的影响 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH值。 由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想。 主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白 例如：工业上生产胰岛素 粗提液 调PH8.0 调PH3.0 去除碱性蛋白质 去除酸性蛋白质 胰岛素 三、有机溶剂沉淀法 许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。 加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。 蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取代，从而降低了它们的溶解度。 有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。 机理分析进展 对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。成本高。 优点 缺点 ①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 ②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。 2、有机溶剂的选择和浓度的计算 不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过试验加以选择。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。 前提：能与水互溶 V = 需加入100％浓度有机溶剂的体积 V0 = 原溶液体积 S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度 S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓度 离子强度 3、有机溶剂沉淀的影响因素 温度 样品浓度 pH值 有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度 样品稳定的pH值范围内，等电点附近 通常溶液中盐浓度以不超过5％为宜 四、非离子多聚物沉淀法 20世纪60年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对