Exp02DNA浓度与纯度的测定要点.pptVIP

一、实验目的 1. 学习UV法检测DNA纯/浓度的基本原理 2. 掌握凝胶电泳检测DNA质量的方法 1. 紫外检测原理 Abs or T% DNA浓度的估算 dsDNA (?g/ml) =50?(OD260) ? 倍数 ssDNA (?g/ml) =33?(OD260) ? 倍数 RNA (?g/ml) = 40?(OD260) ? 倍数 DNA: A260/A280= 1.8 RNA: A260/A280= 2.0 残留酚(270nm)、蛋白 2. 琼脂糖凝胶电泳法 影响DNA迁移率的因素 DNA分子大小与构型 琼脂糖的浓度与质量 电压大小(＜5V/cm) 缓冲液pH EB检测原理 无毒性 灵敏度高 稳定性高 信噪比高 三、实验材料、设备及耗材 E.c DNA提取液 50?TAE: 2 mol/L Tris碱,1 mol/L乙酸, 50 mmol/L EDTA (pH8.0) GelStain染液;EB(1mg/ml) 6?上样缓冲液 Marker: ?DNA Hind Ⅲ (50 ng/?l) 实验用具及耗材 四、实验步骤 TE buffer稀释:50?、100? 旋涡振荡,混匀,离心 预热15 min CK: 600?l DW,校零 样品测试,A260、A280 2. 琼脂糖凝胶电泳 18ml (0.8%Aga) 1?TAE→溶解→50℃→2?l染液→灌胶 5?l DNA样品+2?l上样液 5 ?l ?Marker 80V, 30? 凝胶成像系统观察 五、作业 ?P81思考题: 2、4；P132思考题: 2 1. 琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？ 2. 核酸电泳中上样缓冲液主要成分与作用是什么? 3. 根据A260/A280值如何来判断DNA溶液的浓度? 4.提取DNA纯度是否合乎要求？浓度多少？ * 实验二 DNA浓度与纯度的测定 二、实验原理 共轭双键 定性/量 dsDNA(1?g/ml): OD260＝0.02 ?OD260＝1 ?50?g/ml RNA浓度的估算 核酸纯度的判断 分子筛 电荷效应 ?凝胶浓度 ?低电压 结合量与DNA大小和含量 GelStain检测特点 TU-1901、石英比色杯、旋涡振荡器 凝胶电泳系统、凝胶成像系统 移液器(10、20、200?l)、吸头及EP管 1. 紫外检测 注意事项 仪器操作 比色杯使用 琼脂糖彻底溶解 防止凝胶穿刺 每种物质都有其特有的、固定的吸收光谱曲线,可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量,这就是分光光度定性和定量分析的基础; TU-1901双光束紫外可见分光光度计; DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在260nm处,吸收低谷在230nm; 在260nm时,DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关,也随构型而有差异,如单双链DNA; 吸光度(absorbance)和透光率(transmittance)可以转化,吸光度等于透光率的负对数; 吸光度越低,透光率就越高; 紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律,即物质在一定浓度的吸光度与它的吸收介质的厚度呈正比 学会使用紫外分光光度计测定吸光度和透光率及样品的光谱扫描 酵母RNA(50?g/ml)的扫描图谱 当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时,会影响DNA吸光度的准确测定.一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230,计算其比值来衡量样品的纯度; 若270nm存在高吸收,表明有酚的干扰; 也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况,所以有必要结合凝胶电泳等方法检测有无RNA,或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质 09级研究生赵品苍提取泰山虫草的核基因组DNA紫外吸收扫描图. 对标准样品来说,浓度为1?g/ml时,DNA钠盐的OD260＝0.02,当OD260＝1时, dsDNA浓度约为50?g/ml, ssDNA浓度约为33?g/ml, RNA浓度约为40?g/ml,寡核苷酸浓度约为30?g/ml (由于底物不同有差异); 紫外分光光度计只用于测定浓度大于0.25 ?g/ml的核酸溶液 若为DNA样品,A260/A280比值大于1.8,说明存在RNA,可以考虑用RNase A处理; 小于1.6,说明样品中存在蛋白质或酚,应再用酚-氯仿抽提,以乙醇沉淀纯化DNA. RNA样品A260/A280比值小于2,应考虑再用酚-氯仿抽提; 噬菌体DNA marker HindII,西红柿,拟南芥核DNA标准样品,老芒麦核DNA 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子(直链多糖),沸水中溶解,45℃开始形成多孔性刚性滤孔,凝胶孔径的大小取决于琼脂糖的浓度.